靶向EpCAM的全人源CAR-T细胞在胰腺癌中的临床前疗效与安全性评估

《Cancer Immunology, Immunotherapy》：Preclinical evaluation of CAR-T cell immunotherapy with a fully human EpCAM-specific scFv against pancreatic cancer

为解决胰腺癌免疫治疗靶点匮乏的难题，研究人员开展了靶向EpCAM的全人源CAR-T细胞疗法研究。该研究证实，该疗法在体外及体内模型中均能特异性杀伤EpCAM阳性胰腺癌细胞，且通过静脉输注在小鼠体内展现出良好的安全性。这为EpCAM作为胰腺癌免疫治疗新靶点提供了有力的临床前证据。

　　

胰腺癌，尤其是胰腺导管腺癌（PDAC），因其侵袭性强、预后极差，素有“癌王”之称。尽管免疫疗法在多种肿瘤中取得了突破，但面对胰腺癌，免疫检查点抑制剂等常规手段却屡屡受挫。究其原因，胰腺癌的肿瘤微环境（TME）异常复杂，其致密的纤维间质、紊乱的血管网络以及高度免疫抑制的微环境，共同构筑了一道坚固的“物理+生物”屏障，使得免疫细胞难以浸润并发挥功能。因此，如何突破这道屏障，精准地激活并引导免疫细胞攻击肿瘤，成为攻克胰腺癌的关键。

在此背景下，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法应运而生。这种“活细胞药物”通过基因工程改造，赋予T细胞识别并攻击特定肿瘤抗原的能力，理论上能够克服肿瘤微环境的抑制，实现精准打击。然而，CAR-T疗法在血液肿瘤中取得的辉煌战绩，在实体瘤领域却进展缓慢。对于胰腺癌而言，选择合适的靶点至关重要。目前，针对HER2、CD133、间皮素（MSLN）等靶点的CAR-T临床试验，大多仅能实现短期疾病稳定或部分缓解，效果有限。近年来，Claudin18.2靶向的CAR-T疗法在胃癌和胰腺癌中展现出令人鼓舞的疗效，这无疑为实体瘤CAR-T治疗带来了新的希望，也再次印证了靶点选择的重要性。

上皮细胞粘附分子（EpCAM）是一种在多种上皮源性肿瘤中高表达的跨膜糖蛋白，在肿瘤干细胞和循环肿瘤细胞中尤为富集，与肿瘤的复发和转移密切相关。在结直肠癌、胃癌、卵巢癌等实体瘤的临床前研究中，EpCAM CAR-T细胞已展现出强大的抗肿瘤活性，并已进入早期临床试验阶段。然而，EpCAM CAR-T疗法在胰腺癌中的应用潜力，尚缺乏系统性的临床前评估。

为了填补这一空白，来自国家疫苗与血清研究所、中国科学院深圳先进技术研究院等机构的研究团队，在《Cancer Immunology, Immunotherapy》杂志上发表了他们的最新研究成果。他们设计并构建了一种基于全人源单链抗体（scFv）的新型EpCAM CAR-T细胞，并利用多种体外和体内模型，全面评估了其在胰腺癌治疗中的疗效与安全性，旨在为EpCAM作为胰腺癌免疫治疗新靶点提供坚实的科学依据。

关键技术方法

本研究采用了一系列严谨的实验体系来评估EpCAM CAR-T细胞的活性。首先，研究人员构建了两种第二代CAR结构（分别包含CD28或4-1BB共刺激域），并利用Jurkat双报告细胞系（J-N/N）进行初步功能验证。随后，将CAR转导至人原代T细胞，通过二维（2D）共培养、三维（3D）肿瘤球体模型以及患者来源的类器官（PDO）模型，系统评估了CAR-T细胞的增殖、细胞因子分泌及杀伤能力。最后，在两种胰腺癌异种移植小鼠模型（BxPC-3和Capan-2）中，通过静脉输注CAR-T细胞，验证了其体内抗肿瘤疗效及安全性。

研究结果

EpCAM CAR信号激活具有抗原依赖性

研究人员首先确认了EpCAM在多种胰腺癌细胞系中高表达，而在正常胰腺导管细胞中不表达。随后，他们将构建的两种CAR（28 CAR和BB CAR）转导至Jurkat双报告细胞系（J-N/N）中。该细胞系在NFAT或NF-κB信号通路激活时，会分别表达绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP）。结果显示，当CAR-J-N/N细胞与EpCAM阳性的胰腺癌细胞共培养时，两种CAR均能诱导GFP和RFP的表达，且信号强度与靶细胞类型相关。重要的是，该信号激活是抗原依赖性的，因为与EpCAM阴性的正常细胞共培养时，未观察到信号激活。

EpCAM CAR-T细胞在体外对胰腺癌细胞具有强大的细胞毒性

将两种CAR转导至人原代T细胞后，研究人员在体外进行了功能验证。与未转导的T细胞（UTD）相比，EpCAM CAR-T细胞在与靶细胞共培养后，表现出更强的增殖能力、更高的CD69激活标志物表达水平，并大量分泌IFN-γ和TNF-α等效应细胞因子。在杀伤实验中，两种CAR-T细胞均能高效、特异地杀伤EpCAM阳性的胰腺癌细胞，而对EpCAM阴性的正常细胞则无显著杀伤作用。

EpCAM CAR-T细胞在三维肿瘤球体模型中展现出特异性杀伤能力

为了模拟更接近体内的肿瘤微环境，研究人员构建了三维肿瘤球体模型。在单一肿瘤球体模型中，两种CAR-T细胞均能有效清除由BxPC-3细胞形成的球体。值得注意的是，28 CAR在杀伤的早期阶段（24小时）表现出比BB CAR更快的起效速度。在混合肿瘤球体模型中（由EpCAM阳性的BxPC-3细胞和EpCAM阴性的正常细胞混合而成），CAR-T细胞能够特异性清除EpCAM阳性的肿瘤细胞，而对EpCAM阴性的正常细胞几乎不造成损伤，充分证明了其杀伤的特异性。

EpCAM CAR-T细胞对患者来源的类器官具有抗肿瘤功能

为了进一步验证其临床相关性，研究人员利用一名胰腺癌患者的胸水样本，建立了患者来源的类器官（PDO）模型。将患者自身的T细胞改造为EpCAM CAR-T细胞后，与PDO共培养。结果显示，CAR-T细胞能够向PDO聚集，并导致PDO发生变形和裂解。同时，共培养上清中乳酸脱氢酶（LDH）的释放量显著增加，IFN-γ和颗粒酶B的分泌水平也显著升高，表明CAR-T细胞在PDO模型中同样能够被激活并发挥杀伤作用。

EpCAM CAR-T细胞在体内有效控制肿瘤生长且安全性良好

最后，研究人员在两种胰腺癌异种移植小鼠模型（BxPC-3和Capan-2）中进行了体内验证。通过静脉输注单剂量的CAR-T细胞，结果显示，与PBS或UTD对照组相比，两种EpCAM CAR-T细胞均能显著抑制肿瘤生长，甚至实现肿瘤的完全消退。在安全性方面，接受CAR-T细胞治疗的小鼠未出现明显的体重下降或器官损伤。组织病理学检查和血清生化指标分析均未发现明显的毒性反应，初步证明了该疗法在体内的安全性。

研究结论与讨论

本研究通过一系列严谨的临床前实验，系统性地证明了靶向EpCAM的全人源CAR-T细胞在胰腺癌治疗中的巨大潜力。研究结论可以归纳为以下几点：

1. 1.
   靶点可行性：EpCAM在多种胰腺癌细胞系中高表达，而在正常胰腺导管细胞中不表达，这为靶向治疗提供了理论基础。
2. 2.
   体外高效性：无论是在二维培养还是更复杂的三维肿瘤球体及患者来源类器官模型中，EpCAM CAR-T细胞均能通过抗原特异性识别，被有效激活，并发挥强大的细胞毒性作用。
3. 3.
   体内有效性：在两种异种移植小鼠模型中，通过静脉输注的EpCAM CAR-T细胞能够有效归巢至肿瘤部位，并显著抑制肿瘤生长，甚至实现肿瘤的完全消退。
4. 4.
   初步安全性：在两种小鼠模型中，接受EpCAM CAR-T细胞治疗的小鼠均未出现明显的体重下降或器官损伤，初步证明了该疗法在体内的安全性。

值得注意的是，本研究还发现，虽然28 CAR和BB CAR在体外杀伤效率上差异不大，但它们在信号激活和细胞因子分泌模式上存在差异，这提示共刺激域的选择会影响CAR-T细胞的功能特性。此外，与单一肿瘤球体模型相比，在混合肿瘤球体模型中，低剂量的CAR-T细胞活性明显减弱，这凸显了使用生理相关性更高的模型来评估CAR-T功能的重要性。

尽管本研究在免疫缺陷小鼠模型中未观察到明显的毒性反应，但作者也指出，该模型并不能完全预测临床治疗中的相关毒性。EpCAM在正常上皮组织中也有表达，因此，在进入临床试验前，仍需在更复杂的模型（如EpCAM人源化的免疫健全小鼠模型）中进一步评估其安全性。

综上所述，这项研究为EpCAM作为胰腺癌免疫治疗的新靶点提供了强有力的临床前证据。该研究不仅证实了EpCAM CAR-T细胞在胰腺癌中的疗效，还初步验证了其安全性，为后续开展针对胰腺癌的EpCAM CAR-T细胞临床试验奠定了坚实的基础，有望为胰腺癌患者带来新的治疗希望。