靶向共享PIK3CA突变HLA II类限制性T细胞受体的发现及其在上皮癌免疫治疗中的应用

《Cancer Immunology, Immunotherapy》：Identification of HLA class II-restricted T cell receptors against shared PIK3CA mutations in patients with epithelial cancers

本研究针对PIK3CA突变作为上皮癌第三大常见突变却缺乏有效免疫靶点的难题，通过系统筛选癌症患者TIL和记忆性PBL，成功鉴定出三例分别靶向N345K和E545K热点突变的HLA II类限制性TCR。这些TCR能特异性识别内源性突变蛋白，并显著抑制肿瘤细胞生长，为开发靶向PIK3CA的"现货型"T细胞疗法提供了新策略。

　　

在癌症免疫治疗领域，靶向肿瘤特异性新抗原的过继性T细胞治疗已成为突破传统治疗瓶颈的重要方向。其中，源自高频突变基因的共享新抗原尤为引人关注，因为它们具有覆盖更广泛患者群体的潜力。PIK3CA作为上皮癌中第三大常见突变基因，其热点突变如H1047R、E545K和N345K等在多种上皮癌中频繁出现，然而针对这些突变的免疫识别研究却相对滞后。尤其令人困惑的是，尽管这些突变具有明确的致癌驱动作用，但机体自然产生的免疫应答却往往较弱，这成为开发有效免疫疗法的关键障碍。

以往研究主要通过体外致敏健康供体外周血淋巴细胞或小鼠疫苗接种模型来获取靶向PIK3CA的T细胞受体（TCR），且所获TCR均限于HLA I类限制性。这种局限性促使研究人员思考：患者体内是否天然存在针对PIK3CA突变的记忆性T细胞？这些细胞能否被有效激活并用于治疗？更重要的是，HLA II类限制性T细胞是否也能识别这些突变，从而提供新的治疗机会？

为解答这些问题，研究团队在《Cancer Immunology, Immunotherapy》上发表了创新性研究成果。他们另辟蹊径，直接从携带PIK3CA突变的癌症患者体内寻找答案，通过对肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和外周血记忆性T细胞的系统筛选，成功捕获了靶向共享PIK3CA突变且受常见HLA II类分子限制的TCR。

研究团队采用的核心技术方法主要包括：从患者肿瘤组织分离培养TIL；通过全外显子测序和RNA测序鉴定个体化突变；使用串联小基因（TMG）和长肽段进行T细胞反应性筛选；通过流式细胞术分选抗原特异性T细胞；采用单细胞测序技术鉴定TCR序列；利用逆转录病毒载体进行TCR基因工程改造；以及建立基于实时活细胞成像的体外肿瘤杀伤评估体系。

Identification of PIK3CA^N345K-specific TCRs in TIL and peripheral blood from a patient with colon cancer

研究人员首先对一名结肠癌患者（编号4367）的TIL进行系统性筛选，发现其中一个TIL亚群（F10）能特异性识别PIK3CA^N345K突变肽段。通过流式分选和TCR测序，首次获得一例靶向该突变的TCR（4367_TCR-1）。令人惊喜的是，当研究人员从同一患者外周血记忆性CD4⁺T细胞中进行体外致敏时，独立发现了另一例具有相同特异性但序列不同的TCR（4367_TCR-2）。这两例TCR均显示对突变肽段具有高亲和力（EC₅₀分别为80 ng/ml和126 ng/ml），且均受HLA II类分子对DPA1 * 01:03/DPB1 * 04:01限制。

功能验证显示，表达这两种TCR的基因工程T细胞能够有效识别并抑制表达相应HLA分子和突变PIK3CA蛋白的肿瘤细胞系生长。特别是在结肠腺癌细胞系CCL-225模型中，两种TCR均表现出显著的肿瘤生长抑制作用，证实了其治疗潜力。

Identification of PIK3CA^E545K-specific TCR in the peripheral blood from a patient with rectal cancer

在另一名直肠癌患者（编号4211）的研究中，虽然TIL筛查未发现阳性反应，但研究人员通过两轮体外致敏其外周血记忆性CD4⁺T细胞，成功鉴定出一例靶向PIK3CA^E545K突变的TCR（4211_TCR-1）。该TCR特异性识别一个10氨基酸的最小表位（EITKQEKDFLW），受HLA-DRB1 * 04:01限制，尽管亲和力相对较低（EC₅₀=2.4 μg/ml），但能够有效识别内源性表达突变蛋白的肿瘤细胞。

值得注意的是，在MCF-7和CCL-225两种内源性表达PIK3CA^E545K蛋白的肿瘤细胞系中，只有在引入相应HLA-DRB1 * 04:01分子后，表达该TCR的T细胞才能有效抑制肿瘤生长，证明了其特异性识别能力。

研究团队还对30例携带不同PIK3CA热点突变的上皮癌患者进行了全面筛查，采用多种方法（包括TIL筛选、记忆性T细胞体外致敏等）寻找特异性T细胞反应。尽管在这些患者中发现了多个其他新抗原的特异性T细胞，但针对PIK3CA突变的反应却极为罕见，仅在上述两例患者中获得成功。这一现象提示PIK3CA确实具有较低的天然免疫原性，可能与其免疫逃避机制有关。

研究结论与意义

本研究首次证实了癌症患者体内天然存在靶向共享PIK3CA突变的HLA II类限制性T细胞，并成功分离出三例具有治疗潜力的TCR。这一发现具有多重重要意义：

从治疗策略角度看，这些TCR针对的是高频出现的共享突变，且受常见HLA II类分子限制，使得开发"现货型"T细胞疗法成为可能。据估算，靶向PIK3CA^N345K的TCR可覆盖约0.32%的美国 Caucasian晚期癌症患者，而靶向PIK3CA^E545K的TCR则可覆盖0.48-0.56%的同类人群，虽然比例看似不高，但考虑到癌症患者基数，实际受益人群相当可观。

从免疫识别机制角度，本研究突破了以往仅限于HLA I类限制性TCR的局限，证明了CD4⁺T细胞在识别肿瘤新抗原中的重要作用。尽管这些TCR在体外显示相对较低的细胞毒性，但CD4⁺T细胞可通过多种间接机制发挥抗肿瘤作用，如激活抗原呈递细胞、分泌炎症因子、招募CD8⁺T细胞等，这些机制在肿瘤微环境中可能比直接杀伤更为重要。

从临床转化角度，虽然一例患者接受4367_TCR-1治疗后未见明显疗效，但这可能受多种因素影响，如T细胞持久性、肿瘤微环境抑制等。未来可通过联合免疫检查点阻断、新抗原疫苗等策略增强疗效。此外，优化T细胞表型（如过表达KLF2和BACH2）也可能提高治疗效率。

本研究为PIK3CA突变相关上皮癌的免疫治疗提供了新的工具和思路，虽然天然免疫原性较低增加了治疗挑战，但通过基因工程技术获得的特异性T细胞仍显示出应用前景。未来需要进一步临床研究来验证这些TCR的治疗价值，并探索与其他治疗方式的联合策略，最终为更多患者带来希望。