EGFR信号剥夺联合CDK4/6抑制在胰腺癌中诱导衰老细胞清除的新策略

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：Deprivation of EGFR signal causes senolysis in PDAC with CDK4/6 inhibition

本刊推荐：针对KRAS突变胰腺导管腺癌(PDAC)患者对KRAS抑制剂疗效有限且易产生耐药的问题，研究人员开展了CDK4/6抑制剂与EGFR信号阻断联合治疗的主题研究。结果表明，CDK4/6抑制剂帕博西尼(palbociclib)诱导细胞衰老的同时，通过SASP(衰老相关分泌表型)和JNK依赖方式上调EGFR信号；剥夺该信号可触发类似senolytic（衰老细胞清除）的凋亡效应。该联合策略在体内外模型中均显著抑制肿瘤生长，为不依赖直接靶向KRAS的PDAC治疗提供了新思路。

　　

在癌症治疗领域，胰腺导管腺癌(PDAC)始终是块难啃的硬骨头。尽管KRAS基因突变是约90%PDAC病例的驱动因素，但直接靶向KRAS的治疗之路却充满挑战：获批的KRAS^G12C抑制剂仅对少数携带该特定突变的患者有效，且肿瘤细胞常通过获得其他基因突变迅速产生耐药。更令人困惑的是，在KRAS驱动的肿瘤中，另一个重要的肿瘤抑制基因RB1却很少发生突变。这背后隐藏着一种微妙的平衡——RAS与RB1在功能上相互拮抗。这就引出了一个关键科学问题：能否利用这种内在的拮抗关系，通过激活RB1来抑制KRAS信号，从而治疗PDAC？

以往研究表明，细胞周期蛋白依赖性激酶4和6(CDK4/6)的抑制剂（如帕博西尼）可以通过抑制RB1蛋白的磷酸化，使其保持活化状态，从而诱导细胞周期G1期阻滞和细胞衰老。然而，在PDAC中，CDK4/6抑制剂单药治疗往往只能引起有限的肿瘤细胞凋亡，多数细胞会进入一种称为“衰老”的休眠状态。这些衰老细胞虽然停止增殖，却并非无害；它们会分泌一系列炎症因子、生长因子和蛋白酶，形成衰老相关分泌表型(SASP)，反而可能促进肿瘤微环境的恶化和治疗抵抗。那么，如何安全有效地清除这些衰老的肿瘤细胞，就成了提高治疗效果的关键。

在这项发表于《细胞死亡与分化》(Cell Death & Differentiation)的研究中，由Chiaki Takahashi领导的研究团队发现了一条连接CDK4/6抑制与EGFR（表皮生长因子受体）信号激活的关键通路，并据此提出了一种极具潜力的联合治疗新策略。研究人员发现，使用CDK4/6抑制剂处理PDAC细胞后，虽然有效地抑制了KRAS的活性，但却意外地激活了EGFR信号通路。这种激活依赖于SASP和JNK（c-Jun N末端激酶）的活性。更重要的是，如果在诱导细胞衰老后，再剥夺EGFR信号（例如使用EGFR抑制剂吉非替尼或中和抗体西妥昔单抗），就能像使用senolytic药物（如navitoclax）一样，特异性地触发衰老细胞的凋亡，从而显著增强抗肿瘤效果。这种“先诱导衰老，再清除衰老细胞”的序贯策略，在细胞模型、细胞系来源的异种移植(CDX)模型以及模拟人类PDAC的基因工程小鼠(KPC模型)中都得到了验证，展现出优于KRAS抑制剂单药治疗的潜力。

为了深入探索这一现象，研究团队运用了多种关键技术。他们利用携带可诱导型活性RB1突变体(RB7LP)的细胞系进行化学文库筛选，以寻找能增强RB1激活效应的协同药物。通过蛋白质免疫印迹(Immunoblotting, IB)和基于CRAF的RAS结合域(RBD)的Pull-down实验，他们动态监测了KRAS^G12C的GTP负载活性变化。转录组测序(RNA-seq)和基因集富集分析(GSEA)帮助揭示了信号通路的全局性改变。细胞衰老通过SA-β-gal（衰老相关β-半乳糖苷酶）染色和SASP因子（如IL-6）的表达进行鉴定。细胞凋亡通过流式细胞术检测Annexin V/PI双染进行评估。此外，研究还包含了体外细胞系（如MIA PaCa-2, PK-45H, PK-1）实验、小鼠CDX模型以及KPC (LSL-Kras^G12D; LSL-Trp53^R172H; Pdx1-Cre)转基因PDAC模型，以全面评估治疗策略的有效性和安全性。

Senolytic agent enhances cell death in PDAC cells treated with CDK4/6 inhibitor

研究首先证实，在三种PDAC细胞系中，CDK4/6抑制剂帕博西尼单药治疗可诱导G1期阻滞和细胞衰老，但仅引起部分凋亡（低于20%）。Bcl-2抑制剂navitoclax作为一种已知的senolytic药物，能够与帕博西尼协同作用，有效清除衰老的PDAC细胞，诱导显著的细胞死亡。这表明清除衰老细胞是增强CDK4/6抑制剂疗效的有效途径。

CDK4/6 inhibitor sensitizes PDAC to ERK inhibitor

通过化学文库筛选，研究人员发现ERK（细胞外信号调节激酶）抑制剂SCH772984和MK-8353能够与帕博西尼或诱导表达的活性RB1突变体(RB7LP)协同，显著诱导PDAC细胞凋亡。这种协同效应依赖于RB1的存在，因为敲除RB1后，PDAC细胞对CDK4/6抑制剂和ERK抑制剂的联合治疗不再敏感。

Suppression of mutant KRAS activity by CDK4/6 inhibitor

机制探索发现，无论是诱导RB7LP表达还是使用帕博西尼处理，都能随着时间的推移逐渐降低GTP结合的活性KRAS^G12C的水平。这验证了激活RB1可以反向抑制致癌KRAS活性的假设，揭示了CDK4/6抑制剂一个此前未被充分认识的作用机制。

CDK4/6 inhibitor induces SASP-mediated EGFR activation

为什么在KRAS活性被抑制的情况下，ERK信号反而被激活？研究人员将目光投向了EGFR。他们发现帕博西尼处理能快速上调EGFR及其家族成员HER2/HER3的磷酸化，且这一现象早于ERK的激活。进一步分析表明，这种EGFR的激活是由SASP介导的：CDK4/6抑制通过NF-κB通路促进了多种EGFR配体（如TGF-α, amphiregulin）的表达和释放。使用NF-κB抑制剂JSH-23可以抑制SASP，并阻断EGFR的激活和细胞衰老的表型。

Deprivation of the EGFR signal synergizes with CDK4/6 inhibition

最关键的治疗启示在于，在帕博西尼诱导衰老后，使用EGFR小分子抑制剂吉非替尼或中和抗体西妥昔单抗剥夺EGFR信号，能够有效逆转衰老表型，并触发大量细胞凋亡，其效果类似于navitoclax。重要的是，治疗顺序至关重要：先使用EGFR抑制剂会阻止衰老的发生，从而削弱联合疗效；而同时或在CDK4/6抑制后给予EGFR抑制剂则能产生强大的协同杀伤作用。这种协同效应同样依赖于RB1的功能。

CDK4/6 and KRAS inhibitors commonly target many pathways to suppress PDAC

研究人员将CDK4/6抑制剂帕博西尼与KRAS^G12C抑制剂sotorasib(AMG-510)进行了直接比较。尽管两者在抑制细胞增殖和诱导衰老方面效果相当，但它们对下游信号的影响存在显著差异：sotorasib能迅速且强烈地抑制KRAS活性和ERK磷酸化，但诱导EGFR激活和SASP的能力较弱；而帕博西尼在缓慢抑制KRAS活性的同时，更强力地激活了JNK和氧化磷酸化(OXPHOS)相关通路，并诱导了更丰富的SASP。此外，帕博西尼与sotorasib联用未显示出显著协同效应，提示它们的作用途径有较大重叠。而EGFR抑制剂与帕博西尼的协同作用远强于其与sotorasib的协同作用。

JNK mediates CDK4/6 inhibitor but not KRAS inhibitor to induce cellular senescence

对衰老机制的深入剖析发现，JNK的激活在帕博西尼诱导的衰老中扮演关键角色，而在sotorasib诱导的衰老中则非必需。JNK抑制剂SP600125能特异性拮抗帕博西尼而非sotorasib引起的线粒体活性氧(MitoSOX)增加和SA-β-gal活性升高。这揭示了两类药物诱导的衰老在分子特征上存在差异，可能解释了其SASP特征的不同。

Simultaneous inhibition of CDK4/6 and EGFR in vivo

最终的体内实验证实了联合治疗的巨大潜力。在携带MIA PaCa-2细胞的小鼠CDX模型和KPC基因工程小鼠PDAC模型中，帕博西尼与吉非替尼或西妥昔单抗的联合用药，相比单药治疗，能显著抑制肿瘤生长、减少增殖标志物Ki-67阳性细胞、诱导凋亡（cleaved caspase-3阳性），并降低肿瘤相关纤维化和转移灶。在KPC模型中，联合治疗还显著延缓了胰腺上皮内瘤变(PanIN)向PDAC的进展。安全性评估显示，治疗剂量的帕博西尼并未在正常组织中引发可检测的广泛细胞衰老。

综上所述，本研究揭示了CDK4/6抑制剂在PDAC中一种新的作用模式：在抑制KRAS活性的同时，通过SASP/JNK依赖的方式意外激活了EGFR生存信号。这一发现指出了EGFR信号是衰老PDAC细胞的“阿喀琉斯之踵”。剥夺该信号能够选择性地清除这些衰老细胞，从而实现强大的抗肿瘤效果。这种CDK4/6抑制剂联合EGFR抑制剂的策略，巧妙地利用了肿瘤细胞在应激下的适应性反应，将其转化为治疗弱点。它不仅为对KRAS抑制剂耐药或不适合的患者提供了有前景的替代方案，而且由于CDK4/6抑制下调KRAS的机制与直接抑制剂不同，可能有助于降低获得性耐药的风险。这项研究为治疗极具挑战性的KRAS突变型胰腺癌开辟了一条新的联合治疗路径，具有重要的临床转化价值。