靶向DDOST通过调控EGFR和PD-L1糖基化增强肝细胞癌中乐伐替尼及免疫治疗疗效

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：Targeting DDOST improves the efficacy of lenvatinib and immunotherapy in hepatocellular carcinoma

本研究针对肝细胞癌(HCC)中乐伐替尼耐药及免疫治疗响应不足的临床难题，系统探讨了寡糖基转移酶非催化亚基DDOST的致病机制。研究人员通过体内外实验证实，敲低DDOST可抑制EGFR N-糖基化并阻断其下游AKT/ERK5信号通路，同时降低PD-L1膜定位，从而协同增强乐伐替尼与PD-1/PD-L1抑制剂的抗肿瘤效果。进一步利用OST抑制剂NGI-1及其纳米颗粒(NGI-1-NPs)验证了靶向糖基化通路的治疗潜力，为HCC联合治疗提供了新策略。

　　

肝细胞癌（HCC）是全球范围内发病率和死亡率均居高不下的恶性肿瘤，尤其在晚期患者中，系统性治疗的效果常因耐药性问题而大打折扣。乐伐替尼（Lenvatinib）作为一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，虽已成为不可切除HCC的一线治疗选择，但其疗效常因获得性耐药而受限。研究表明，表皮生长因子受体（EGFR）的异常激活是导致乐伐替尼耐药的关键机制之一。与此同时，肿瘤细胞通过程序性死亡配体1（PD-L1）的糖基化修饰实现免疫逃逸，也削弱了免疫检查点抑制剂的疗效。因此，探寻能同时克服靶向治疗耐药并改善免疫微环境的共同调控枢纽，成为HCC治疗领域的迫切需求。

在这项发表于《Experimental & Molecular Medicine》的研究中，作者团队将目光投向了蛋白质N-糖基化过程的关键复合物——寡糖基转移酶（OST）。该复合物的非催化亚基DDOST在多种癌症中高表达，但其在HCC中的具体功能及治疗价值尚不明确。研究人员通过临床样本分析、细胞与动物实验以及分子机制探索，系统揭示了DDOST通过调控EGFR和PD-L1的糖基化，双重影响乐伐替尼敏感性与抗肿瘤免疫的生物学过程，并开发了相应的干预策略。

为开展本研究，作者运用了以下主要技术方法：使用临床HCC组织样本（来自西安交通大学第一附属医院）进行蛋白与基因表达分析；通过RNA干扰（siRNA/shRNA）及过表达质粒在HCC细胞系中调控DDOST表达；采用MTT法、克隆形成实验及流式细胞术评估细胞增殖、周期与药物敏感性；利用蛋白质印迹（Western blot）、免疫荧光及免疫组化分析关键蛋白表达与定位；通过纳米沉淀技术制备NGI-1负载纳米颗粒（NGI-1-NPs）并评价其体内外抗肿瘤效果；基于流式细胞术和ELISA检测肿瘤免疫细胞浸润及细胞因子水平。

DDOST在HCC组织中表达上调并与患者不良预后相关

通过对癌症基因组图谱（TCGA）数据库的分析，发现OST多个亚基（包括DDOST）在HCC组织中表达显著升高。生存分析进一步显示，DDOST高表达与患者总生存期（OS）及疾病特异性生存期（DSS）缩短密切相关。在临床组织样本中，通过Western blot、免疫荧光（IF）和qRT-PCR验证了DDOST在蛋白和mRNA水平均显著上调。

DDOST敲低抑制HCC细胞恶性行为并增强其对乐伐替尼的反应

在MHCC97H、Li-7和Huh7等HCC细胞系中敲低DDOST后，细胞增殖和克隆形成能力显著抑制，细胞周期阻滞于G2/M期，并伴随p21Waf1/Cip1上调及细胞周期蛋白（cyclin A1、B1、D1）下调。在裸鼠移植瘤模型中，DDOST敲低同样抑制了肿瘤生长。更重要的是，DDOST敲低显著降低了乐伐替尼的半数抑制浓度（IC₅₀），并增强了乐伐替尼在体外和体内对HCC的抑制作用。

50值。b-c MTT与克隆形成实验显示DDOST敲低增强乐伐替尼的增殖抑制效果。d-f 体内实验显示DDOST敲低联合乐伐替尼显著抑制肿瘤生长。g 肿瘤组织Ki-67 IHC染色统计结果。'>

DDOST通过调控EGFR信号通路参与乐伐替尼耐药

利用ER-LucT报告系统证实DDOST参与蛋白N-糖基化过程。Western blot结果显示，DDOST敲低或OST抑制剂NGI-1处理可减少EGFR的糖基化修饰，导致其分子量下降、膜定位丧失，并抑制其磷酸化及下游AKT（Ser473/Thr308）和ERK5的激活。在乐伐替尼处理过程中，DDOST敲低可阻断由EGFR介导的ERK1/2信号反弹，从而逆转耐药。

DDOST敲低阻碍PD-L1糖基化及其膜定位

研究进一步发现DDOST敲低或NGI-1处理可减少PD-L1的完全糖基化形式，促进其低分子量（33 kDa）非糖基化形态积累，并降低其在细胞膜表面的表达。TCGA数据分析显示，DDOST高表达与肿瘤微环境中CD8⁺T细胞浸润减少及免疫抑制性Th2细胞增多相关，提示DDOST可能通过调控PD-L1糖基化影响抗肿瘤免疫。

NGI-1通过抑制EGFR糖基化增强乐伐替尼疗效

OST抑制剂NGI-1在体外可剂量依赖性地抑制HCC细胞增殖、克隆形成并诱导G2/M期阻滞，其作用机制与DDOST敲低类似。NGI-1处理同样能抑制EGFR糖基化、阻断其信号传导，并显著增强乐伐替尼的细胞毒性作用。

50。e-f NGI-1与乐伐替尼联合使用增强抗肿瘤效果。g-h NGI-1剂量依赖性地抑制EGFR糖基化。i IF显示NGI-1处理导致EGFR膜定位消失。j-k NGI-1抑制EGF刺激或乐伐替尼处理后的EGFR下游信号激活。'>

NGI-1纳米颗粒的制备及其抗肿瘤效果

为解决NGI-1水溶性差的问题，研究采用聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PEG-PLGA）制备了NGI-1纳米颗粒（NGI-1-NPs）。该纳米颗粒粒径均匀（约79 nm），可有效抑制EGFR糖基化。在移植瘤模型中，NGI-1-NPs单用或与乐伐替尼联用均能显著抑制肿瘤生长，且未引起明显的肝肾功能损伤或血液学毒性。

NGI-1-NPs增强免疫治疗效果

在H22细胞诱导的免疫活性小鼠模型中，NGI-1-NPs处理可降低肿瘤细胞表面PD-L1表达，促进CD8⁺和CD4⁺T细胞浸润，并提升干扰素-γ（IFN-γ）和颗粒酶B（Granzyme B）水平。与抗PD-1或抗PD-L1抗体联用时，NGI-1-NPs进一步增强了免疫治疗的抗肿瘤效果。

结论与展望

本研究系统阐明了OST非催化亚基DDOST在HCC中的致癌作用及其调控乐伐替尼耐药与免疫逃逸的双重机制。DDOST通过促进EGFR和PD-L1的N-糖基化，分别激活下游致癌信号通路和维护免疫抑制微环境。靶向DDOST或使用OST抑制剂NGI-1可有效逆转上述过程，为HCC的联合治疗提供了新思路。

该研究不仅深化了对糖基化修饰在肿瘤进展中作用的理解，也验证了NGI-1纳米制剂在改善药物递送与治疗效果方面的潜力。未来研究可进一步探索DDOST在OST复合物之外的独立功能，并优化靶向策略以降低潜在毒性，推动其向临床转化。