综述：EGLN1(PHD2)在肿瘤微环境中的作用：治疗靶向新见解

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：EGLN1 (PHD2) role in tumor microenvironment: insights for therapeutic targeting

本综述系统阐述了氧感受器EGLN1(PHD2)在肿瘤微环境(TME)中的核心调控作用。作者指出，PHD2不仅通过HIF-1α通路影响肿瘤细胞，更通过调控内皮细胞、成纤维细胞及免疫细胞重塑TME。文章强调，靶向PHD2可诱导血管正常化、抑制肿瘤相关成纤维细胞(CAF)活化并增强T细胞抗肿瘤活性，为将已获批的PHD抑制剂(如罗沙司他)重新用于癌症治疗提供了理论依据。

　　

EGLN1-DEPENDENT RESPONSE TO HYPOXIA IN THE TME

缺氧不仅影响癌细胞，也深刻影响肿瘤微环境(TME)中的宿主细胞群，包括内皮细胞、成纤维细胞和不同的免疫群体。EGLN1基因已被证明在调节这些群体对缺氧的反应中发挥关键作用，支持各种促癌或抑癌功能。

Angiogenesis

血管生成是肿瘤生长和转移的关键。然而，肿瘤血管通常结构不成熟、功能失调，导致缺氧加剧和药物输送困难。PHD2似乎是调节成年小鼠血管生成的关键PHD亚型，其缺陷会导致血管生成过度活跃。

在癌症生长的同系移植模型中，宿主细胞中的EGLN1单倍体缺陷会诱导内皮细胞排列正常化，从而改善肿瘤氧合和药物扩散，并减少转移。此外，髓系细胞中诱导性PHD2敲除通过减弱巨噬细胞的促炎表型来改善血管生成。

然而，内皮和造血细胞中完全敲除PHD2会导致广泛的肺血管重塑，包括血管闭塞和丛状病变，重现了肺动脉高压的病理。相反，内皮细胞中PHD2的过表达会抑制缺氧诱导的细胞增殖。

PHD2的缺失可能通过增加HIF-1α的稳定性以及其他旁路途径来增强血管生成和血管发生。事实上，PHD2抑制以HIF非依赖性和NF-κB依赖性方式诱导促血管生成因子（如IL-8和血管生成素）的释放。这些因子介导肿瘤血管生成和骨髓来源细胞的募集。

总体而言，所有证据表明，PHD2水平对于生理条件下的正确血管生成至关重要。相反，在血管生成被异常刺激的癌症中，降低PHD2水平或活性可能导致血管正常化。

Fibroblasts

癌症相关成纤维细胞(CAF)被癌细胞直接或间接重编程，以被激活并产生细胞外基质，从而促进微环境重塑。此外，活化的CAF通过其自噬途径向癌细胞提供高能物质，包括酮体和乳酸。

TME是高度氧化的。这激活了基质成纤维细胞中的两条促自噬途径：一条由HIF-1α驱动，另一条由NF-κB协调。结果，CAF启动自噬和线粒体自噬，导致代谢和蛋白质组重编程。自噬维持癌细胞生长，因为CAF碎片和营养物质可以被回收。同时，HIF-1α诱导的线粒体自噬增强了有氧糖酵解，CAF分泌的高能营养物质可以进一步促进癌细胞的氧化代谢。

然而，成纤维细胞中的自噬在早期阶段也可以抑制肿瘤进展，因为分泌的中间产物可能激活免疫细胞。相反，CAF自噬在肿瘤发展的后期时间点促进TME炎症、缺氧和免疫检查点的调节。

在胰腺导管腺癌(PDAC)中，肌成纤维细胞样CAF以αSMA表达为特征，被认为具有肿瘤抑制作用，而炎性CAF(iCAF)表达较低水平的αSMA，产生炎性细胞因子并增强肿瘤生长。缺氧增强了PDAC细胞分泌的细胞因子的作用，导致向iCAF表型的转变，这与较差的癌症预后和耐药性相关。在这种情况下，HIF-1α的稳定诱导了iCAF表型，而分泌的细胞因子以自我循环的方式协同增强HIF-1α的转录活性。

然而，长时间的缺氧会使CAF失活，并降低其重塑和侵袭周围基质的能力。事实上，体外用PHD抑制剂二甲基草酰甘氨酸(DMOG)处理或PHD2沉默会导致CAF失活和细胞外基质重塑，这一过程依赖于HIF-1α。这些发现与在EGLN1单倍体缺陷背景下产生的自发性乳腺肿瘤发生模型中的结果相似。这些小鼠表现出与EGLN1野生型相同的主要肿瘤生长，但由于CAF活化减少和血管改善，转移减少。此外，作者表明CAF损伤不是由于PHD2在CAF中的抑制，而是由于癌细胞中的抑制。事实上，EGLN1单倍体缺陷的癌细胞分泌较少的TGF-β，这反过来导致CAF活化减少。

因此，抑制或降低PHD2活性可能对抑制肿瘤进展和CAF的促肿瘤支持至关重要。

Macrophages

肿瘤相关巨噬细胞(TAM)可以根据其受体表达、效应功能和细胞因子产生进行聚类和表征。几种微环境信号可以在体内和体外诱导M1或M2极化。经典活化的M1巨噬细胞通常是杀死微生物和肿瘤细胞的效应细胞，而替代活化的M2细胞抑制炎症反应、清除碎片并促进血管生成。M1巨噬细胞分泌IL-12和肿瘤坏死因子(TNF)，而M2巨噬细胞通常产生IL-10。

M1样巨噬细胞可以在肿瘤发生的早期阶段在TME中发现，此时促炎反应仍在进行中。它们进一步激活效应免疫细胞，如CD8⁺细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞。TNF是M1极化的正调节因子，当NF-κB通路被激活时，是M2极化的负调节因子。此外，髓系分化初级反应88(MyD88)抑制TAM中M2相关基因的表达，导致抗肿瘤M1表型极化。

高M1/M2 TAM比率与非小细胞肺癌、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌和口腔鳞状细胞癌的较好预后相关。相反，高M2百分比与较差的结果相关，并在炎症较少的TME中茁壮成长，有利于肿瘤生长。

强烈的缺氧TME和大量的TAM与生存率降低相关。M2巨噬细胞表达低水平的MHCII复合物或HLA-DR（分别在小鼠和人类中），并在人类肿瘤内部最缺氧的区域发现。代谢与TAM功能紧密相连，特别是M1，高MHCII表达表现出受阻的TCA循环。相反，与M1 TAM相比，M2 TAM显示出更高的氧化和糖酵解代谢，M1 TAM显示出较少的线粒体活性。这些M2 TAM可以利用乳酸为其活动提供燃料，增加L-精氨酸代谢并增强其T细胞抑制能力。HIF-1α对于体内巨噬细胞的活化和浸润至关重要。这些细胞中的HIF1A敲除导致糖酵解能力受损和ATP产生急剧减少。HIF-1α的表达也是髓系细胞杀死致病菌所必需的。

M2 TAM与缺氧区域相关，而M1 TAM优先位于氧合较好的区域。EGLN1单倍体缺陷诱导血管系统正常化并增强小鼠的肿瘤氧合。在该系统中，氧气可用性不会改变单核细胞向肿瘤部位的吸引，也不会改变单核细胞分化为M2或M1 TAM的效率。较少的缺氧不影响M2标志物的表达，尽管它下调了参与血管生成、转移和缺氧反应的典型基因的表达。Laoui及其同事得出结论，肿瘤浸润单核细胞不会因缺氧而分化失败，而是受到其他微环境刺激的影响。它们被吸引到缺氧区域，在那里执行其促肿瘤活动。在体外，EGLN1敲除通过增加丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)蛋白水平和降低丙酮酸脱氢酶活性，诱导髓系细胞代谢重编程向无氧糖酵解，而HIF1A敲除抑制这种糖酵解重编程。糖酵解转变的抑制也抑制了巨噬细胞的迁移和功能。这些发现与另一份报告一致，该报告显示髓系细胞中HIF-1α的耗竭显著降低了葡萄糖转运蛋白和糖酵解酶的表达，导致有缺陷的炎症反应。

在肺癌和黑色素瘤的同系移植模型中，用PHD2抑制剂罗沙司他治疗通过增加巨噬细胞的吞噬活性和通过PHD-HIF轴诱导肿瘤血管正常化来减少肿瘤生长。

T lymphocytes

T细胞是浸润实体瘤的最具代表性的免疫群体之一，被TME分泌的因子招募到肿瘤部位。在那里，它们可以具有不同的表型分化和功能。细胞毒性CD8⁺T细胞识别肿瘤细胞的新抗原并杀死肿瘤细胞，在其膜上产生穿孔素和颗粒酶孔，并通过IFNγ和TNF通路诱导细胞凋亡。根据其抗肿瘤功能，它们的数量通常与较好的预后相关。

CD4⁺T细胞具有更多可变的作用。在大多数情况下，抗炎TME使它们具有调节功能(Treg)。这些Treg细胞已在几种实体癌中被表征。它们的主要活动之一是分泌抗炎细胞因子，这些细胞因子阻碍其他T细胞功能并促进肿瘤生长和转移。CD4⁺T细胞也可能分化为T辅助细胞，招募并激活自然杀伤细胞和CD8⁺T细胞到肿瘤部位。

HIF-1α在T细胞中的作用相当有争议。缺氧诱导CD8⁺T细胞的代谢转变，从而增强其抗肿瘤活性。另一方面，缺氧的CD8⁺T细胞由于代谢重塑而增殖能力下降。

然而，在已经启动的CD8⁺T细胞中同时删除EGLN1和EGLN3基因增强了它们的效应活性。当这些细胞过继转移到几种小鼠癌症模型中时，它们减少了肿瘤生长。同样相关的是，在缺氧条件下培养CD8⁺T细胞通过增加葡萄糖代谢和颗粒酶/穿孔素颗粒产生，在体内增强了它们的抗肿瘤活性。这种效应不依赖于IFNγ分泌，尽管其mRNA上调。

T淋巴细胞中EGLN1的基因缺失增加了EG7-OVA肿瘤杀伤活性。与野生型对照相比，这些细胞对IFNγ、TNF和颗粒酶B的细胞内阳性染色增加。CD4⁺T细胞中HIF-1α的稳定改善了抗PD-1治疗减少肿瘤生长和患者生存的效果。类似地，T细胞中的VHL缺失导致HIF-1α积累，在慢性病毒感染期间阻止了CD8⁺T细胞的耗竭。此外，T细胞中PHD蛋白的表达需要诱导对肺转移的耐受性，这是由于Treg细胞增加和CD8⁺T细胞效应功能减少。因此，T细胞特异性删除所有三个PHD或药理学抑制限制了肺定植并改善了过继转移免疫疗法的效果。

值得注意的是，PHD抑制剂通过HIF-1α稳定和共刺激分子的诱导激活CD8⁺T细胞，导致过继T细胞疗法的抗肿瘤功效增加。

HYPOXIA PATHWAY PHARMACOLOGICAL TARGETING FOR CANCER TREATMENT: TIME TO INCLUDE PHD INHIBITORS?

由于缺氧与肿瘤之间的密切联系，靶向该通路被认为是克服不同类型癌症的有前途的策略。该通路中的主要药理学靶点是PHD酶、HIF转录因子和HIF主要效应物，如VEGF。后者是一个成熟的药物靶点，特定的单克隆抗体如贝伐珠单抗已在临床实践中使用了近20年。抗VEGF药物最初是为了抑制缺氧诱导的血管生成而开发的，旨在饿死肿瘤并抑制转移扩散。然而，这些治疗在单药治疗中的疗效有限，并且在与其它药物联合使用时仍局限于某些癌症类型。值得注意的是，出现了其他作用机制，如血管系统正常化和免疫调节，部分解释了肿瘤特异性效应，并表明了更合理组合的可能性。

由于HIF转录因子在癌细胞调节中的关键作用及其在促进免疫抑制微环境中的多方面作用，长期以来它们一直被认为是有前途的靶点。几种药物已被证明直接或间接靶向HIF因子表达、蛋白质合成、稳定和二聚化。然而，这些抑制剂中的大多数除了其他通路外还间接调节HIF，使得难以区分HIF依赖性效应。2009年，Scheuermann及其合作者在HIF-2α的PAS-B结构域内发现了一个空腔，该空腔不存在于HIF-1α中，从而开发了HIF-2α与HIF-β亚基二聚化的特异性抑制剂。Belzutifan是这些抑制剂中最先进的，在VHL相关癌症（如ccRCC和血管母细胞瘤）的临床前模型和临床试验中证明了疗效，并于2021年获得美国食品和药物管理局批准用于这些适应症。Belzutifan与其他抗癌药物（包括免疫疗法）的组合目前正在几项临床试验中进行研究。

一个相对较新的策略提出缓解TME缺氧本身，导致HIF活性同时下调，并伴随TME重编程，包括促进免疫细胞招募和活化。这些效应可以通过血管正常化来实现，导致氧气和营养物质浓度增加，但也促进免疫细胞浸润和抗癌药物输送。

Mazzone及其同事开发了一个携带宿主动物EGLN1单倍体缺陷的同系移植小鼠模型，并表明PHD2缺陷导致血管正常化，改善肿瘤灌注和氧合，并抑制转移扩散。在该模型中，PHD2的缺失还导致更好的化疗药物输送和正常器官免受化疗副作用的影响。此外，T细胞中EGLN1的缺失促进了效应T细胞的分化，改善了肿瘤控制和免疫检查点阻断治疗的反应。值得注意的是，癌细胞中PHD2的基因或药理学抑制根据癌症类型具有可变效应，在黑色素瘤、肺、卵巢和骨肉瘤癌症中显示出抗致癌活性。总之，这些证据表明，通过药理学方法系统抑制PHD2可能通过对癌细胞和TME的双重效应发挥抗癌活性，至少在部分癌症类型中如此。

PHD酶抑制剂已被开发用于治疗其他疾病，如贫血和缺血。不同PHD抑制剂的临床试验显示在管理慢性肾病相关贫血方面具有疗效且副作用有限，导致罗沙司他、达普司他和伐达司他在不同国家被批准用于治疗该病理。这些结果表明，PHD抑制剂在肿瘤疾病中的使用也可能是安全的，并且可以重新用作能够影响癌细胞和TME的药物。

值得注意的是，所有可用的抑制剂都依赖于与2-OG辅因子的竞争，该辅因子由所有三种酶共享，也由超家族的其他双加氧酶共享。由于三种PHD酶在不同的癌症背景下扮演不同的角色，可能会出现特异性问题。所有测试的抑制剂在体内诱导红细胞生成，而在体外显示出一些亚型特异性。然而，由于PHD蛋白在癌症中的不同功能，在重新用于肿瘤学背景之前，应仔细评估每种抑制剂对三种PHD酶和下游通路的活性。此外，这些抑制剂对其他双加氧酶的活性通常研究较少，应予以考虑。理想情况下，开发亚型选择性抑制剂对于精确靶向这些酶和限制不希望的副作用将是最佳的。

CONCLUSIONS

总之，EGLN1/PHD2被认为是细胞对缺氧反应的关键调节因子。此外，它可以触发一系列其他代谢和调节机制，影响整个TME。PHD2活性可能根据背景（包括肿瘤亚型或TME细胞群）产生不同的结果。然而，在大多数情况下，PHD2触发一系列事件，促进肿瘤生长，驱动异常血管形成，并抑制免疫细胞活性。由于这些原因，抑制PHD2可能代表一种新颖且有效的抗癌策略，因为它同时影响癌细胞和TME。尽管几种PHD抑制剂已用于治疗贫血的临床实践，但可能会出现特异性问题并限制其在肿瘤学中的使用。因此，产生新的、更强和更具选择性的抑制剂可能有利于为抗癌治疗最佳靶向这种有趣的蛋白质。