柑橘果皮瘢痕的“身份危机”：宏条形码技术揭示非检疫性Elsinoe物种的存在及其对植物检疫诊断的挑战

《European Journal of Plant Pathology》：Presence of non-regulated Elsino? species on citrus fruits and their impact on regulatory plant health diagnostics

为解决欧盟柑橘进口检疫中Elsinoe属病原菌诊断特异性不足的问题，研究人员利用ITS1宏条形码技术对来自9个国家的53份柑橘病果样本进行了分析。研究意外发现，病果上存在多种非检疫性Elsinoe物种，且其症状与检疫性物种（E. fawcettii和E. australis）高度相似。该结果揭示了现行属水平检测方法的局限性，并强调了在诊断方法验证中纳入非检疫性近缘种的必要性。

　　

当你拿起一个橙子，发现果皮上布满了粗糙、疣状的瘢痕，这通常被认为是柑橘疮痂病的典型症状。在植物检疫领域，这类症状是拉响警报的信号，因为它可能意味着存在三种受欧盟严格检疫的Elsinoe属真菌：E. fawcettii、E. australis和E. citricola。长期以来，植物检疫诊断依赖于一个看似合理的假设：只有这三种受管制的Elsinoe物种会感染柑橘。因此，荷兰等欧盟主要进口口岸的检疫策略是，先使用一种高灵敏度的属水平实时荧光定量PCR（real-time PCR）进行初筛，一旦检测呈阳性，再结合症状分析、寄主植物种类和水果原产地等信息，来推断是否存在检疫性有害生物。

然而，这套看似严密的诊断体系正面临挑战。在常规检测中，检疫人员发现了一些令人困惑的案例：来自西班牙（已知无检疫性Elsinoe物种分布）的柑橘样本检测呈阳性；另一些样本虽然检测呈阳性，但Cq值（循环阈值）很高，表明病原体含量极低。这些“异常”样本的出现，对Elsinoe物种严格的寄主专化性假说提出了质疑。为了解开这个谜团，研究人员决定采用宏条形码（metabarcoding）技术，对来自世界各地的柑橘病果样本进行深度测序，试图一探究竟。

关键研究方法

为了验证柑橘病果中Elsinoe物种的真实身份，研究人员开展了一项基于高通量测序的宏条形码研究。他们从2022年9月至2024年7月期间，在荷兰植物检疫常规检查中采集了53份有症状的柑橘样本，这些样本来自巴西、哥伦比亚、印度尼西亚、秘鲁、南非、西班牙、泰国、越南和津巴布韦等9个国家，涵盖了5种柑橘寄主。研究团队首先使用Elliott等人开发的属水平实时荧光定量PCR方法对样本进行检测，随后对PCR阳性样本的核糖体DNA（rDNA）进行扩增，并利用Illumina NextSeq 2000平台进行高通量测序。通过生物信息学分析，他们将测序得到的序列与已知的Elsinoe物种ITS1参考序列进行比对和聚类分析，以确定样本中存在的Elsinoe物种类型。

研究结果

1. 宏条形码揭示柑橘上存在非检疫性Elsinoe物种

宏条形码分析结果令人惊讶。在来自9个国家的53份样本中，研究人员成功获得了46个可靠的Elsinoe物种ITS1序列。系统发育分析显示，这些序列并非只属于已知的三种检疫性物种，而是广泛分布在五个不同的进化枝（clade）中。其中，仅有11个序列（代表10个批次）的序列与包含检疫性物种的进化枝（进化枝1和5）聚在一起。而其余35个序列则明确地归属于仅包含非检疫性Elsinoe物种的进化枝（进化枝2、3和4）。这一发现直接证实了非检疫性Elsinoe物种确实存在于进口的柑橘果实上，打破了“只有三种Elsinoe物种感染柑橘”的固有认知。

2. 症状与病原物种类无必然关联

症状学分析进一步揭示了现行诊断方法的局限性。研究人员将观察到的症状分为三类：典型E. fawcettii症状（疣状、粗糙、不规则）、典型E. australis症状（较大、较平坦、较光滑）以及非典型症状。令人意外的是，在仅检测到非检疫性Elsinoe物种的样本中（例如进化枝2和3），同样观察到了典型的E. fawcettii或E. australis症状。例如，来自哥伦比亚和巴西的样本，其序列属于进化枝2（包含E. centrolobii、E. fici等非检疫性物种），但果皮上却呈现出典型的E. fawcettii症状。反之，在序列属于进化枝5（包含检疫性物种E. australis）的样本中，却观察到了典型的E. fawcettii症状。这些结果表明，仅凭症状学无法可靠地区分检疫性Elsinoe物种与其他生物，包括新发现的非检疫性Elsinoe物种。

3. 宏条形码检测灵敏度低于实时荧光定量PCR

研究还比较了宏条形码与实时荧光定量PCR的检测灵敏度。在Cq值低于30的34份样本中，宏条形码成功获得了31份样本的完整Elsinoe ITS1条形码，成功率为91%。然而，在Cq值高于30的19份样本中，仅有3份样本获得了完整的条形码，成功率仅为16%。这表明宏条形码的检测灵敏度低于实时荧光定量PCR。这种灵敏度的差异主要归因于宏条形码PCR过程中，来自寄主植物或其他真菌（如Alternaria、Cladosporium等）的DNA会与目标DNA竞争扩增，从而限制了Elsinoe序列的回收率。

结论与讨论

本研究通过ITS1宏条形码技术，首次在柑橘果实上证实了非检疫性Elsinoe物种的存在。这一发现对植物检疫诊断实践产生了深远影响。它表明，基于属水平检测的现行诊断策略存在重大缺陷，因为一个阳性的属水平检测结果，可能仅仅意味着存在非检疫性物种，而非受管制的有害生物。因此，仅凭症状、寄主和原产地信息进行推断的检疫决策模式已不再可靠。

为了应对这一挑战，研究人员提出了两个关键方向。首先，必须对现有的诊断方法进行更广泛的验证。在验证诊断方法的专一性（exclusivity）时，必须将新发现的、在柑橘上存在的非检疫性Elsinoe物种纳入测试范围，以确保检测方法能够准确区分检疫性病原体与其近缘的非检疫性物种。其次，需要对这些非检疫性物种进行准确的鉴定。宏条形码技术虽然能揭示物种的存在，但无法提供精确的物种鉴定。因此，必须通过传统的真菌分离培养、形态学观察和测序等方法，来明确这些物种的身份。

从监管角度来看，非检疫性Elsinoe物种的发现给植物检疫决策带来了新的复杂性。监管机构需要在高度灵敏但非特异的属水平检测、尚未完全验证的种水平检测以及完全不进行检测之间做出权衡。这一选择取决于进口国可接受的植物检疫风险水平、诊断方法的可靠性以及相关法规框架的要求。如果未来的致病性测试证明，这些非检疫性Elsinoe物种确实能对柑橘造成危害，那么它们的监管地位可能需要根据植物健康法规框架进行重新评估。因此，监管机构与诊断专家之间的紧密合作至关重要，以确保植物健康决策既科学合理，又与实际的植物检疫风险相称。