F-BAR蛋白Rga7与Rga8通过相分离驱动皮层富集以维持细胞完整性

《Cellular and Molecular Life Sciences》：Phase separation drives cortical enrichment of the F-BAR proteins Rga7 and Rga8 to maintain cell integrity

本研究揭示了裂殖酵母F-BAR蛋白Rga7和Rga8通过其F-BAR结构域发生液-液相分离(LLPS)，这一过程依赖于其尖端带电荷残基介导的静电相互作用。相分离是Rga7和Rga8在细胞尖端富集的关键机制，两者协同作用，通过调控Rho GTPase、外泌体复合物及葡聚糖合酶等关键因子的精确定位，共同维持细胞壁完整性，防止细胞裂解。

　　

细胞如何维持其形态和完整性，是生命科学领域一个经久不衰的谜题。在细胞生长、分裂和迁移等过程中，细胞膜需要不断地重塑，这一过程离不开一类名为BAR结构域蛋白的“分子建筑师”。其中，F-BAR蛋白因其细长的结构，被认为在感知和生成膜曲率方面扮演着重要角色。然而，这些F-BAR蛋白是如何在细胞特定区域（如生长尖端）精准定位并发挥功能的，其背后的分子机制尚不明确。

在裂殖酵母中，Rga7和Rga8是两个结构相似的F-BAR蛋白，它们都含有一个F-BAR结构域和一个RhoGAP结构域。有趣的是，当这两个基因同时缺失时，细胞会因无法维持细胞壁完整性而裂解死亡，这表明它们在维持细胞生存方面具有协同作用。那么，Rga7和Rga8是如何协同工作的？它们又是如何被招募到细胞尖端，从而执行其关键功能的呢？

为了回答这些问题，中国科学技术大学傅传海教授团队在《Cellular and Molecular Life Sciences》上发表了一项研究，揭示了F-BAR蛋白Rga7和Rga8通过一种名为“液-液相分离”的机制，在细胞尖端形成生物分子凝聚体，从而协同调控细胞极性，维持细胞完整性。

研究人员综合运用了多种技术手段来验证其科学假说。他们首先通过遗传学分析（如四分子分析、AID系统）和细胞生物学方法（如活细胞成像、FRAP）在体内验证了Rga7和Rga8的功能协同性及其动态特性。随后，利用生物化学方法（如蛋白质纯化、凝胶过滤层析、GST pull-down、免疫共沉淀）和体外相分离实验，证明了F-BAR结构域具有相分离能力，并阐明了其分子机制。最后，通过构建相分离缺陷突变体，结合细胞表型分析，在体内外验证了相分离对于蛋白定位和细胞功能的重要性。

Rga7与Rga8协同作用以维持细胞生存能力

研究人员首先通过遗传学分析发现，同时缺失Rga7和Rga8会导致细胞死亡，而缺失Rga9则不会产生这种效应，这表明Rga7和Rga8在功能上具有协同性。利用AID系统（一种可诱导的蛋白降解系统）在rga8缺失的细胞中快速降解Rga7，研究人员观察到细胞在短时间内发生裂解，进一步证实了这两个蛋白对于维持细胞完整性至关重要。

Rga7和Rga8在细胞间期富集于细胞尖端

通过荧光标记和显微观察，研究人员发现Rga7和Rga8在细胞间期主要富集于细胞尖端，而Rga9则弥散在细胞质中。Rga7和Rga8在细胞尖端存在共定位，但Rga8在细胞质中还呈现出额外的点状信号，提示其可能定位于内膜系统。

Rga7和Rga8协同调控Rho GTPase、外泌体复合物及葡聚糖合酶的尖端定位

为了探究Rga7和Rga8如何协同工作，研究人员发现它们的尖端定位存在部分相互依赖。更重要的是，当同时缺失Rga7和Rga8的功能时，Rho GTPase（Rho1和Rho2）、外泌体复合物亚基（Sec3和Exo70）以及葡聚糖合酶（Ags1和Bgs1）在细胞尖端的定位均被显著破坏。这些因子的错误定位直接导致了细胞壁合成缺陷和细胞裂解，从而解释了双缺失细胞致死的分子原因。

Rga7和Rga8的F-BAR结构域发生液-液相分离

研究人员在体外纯化了Rga7和Rga8的F-BAR结构域，发现它们能够自发地形成液滴，即发生液-液相分离。这一过程依赖于蛋白质浓度和盐浓度。Rga8的F-BAR结构域表现出更强的相分离能力。当将Rga7和Rga8的F-BAR结构域混合时，它们能够发生共相分离，形成更大的液滴，并且两者之间存在直接的物理相互作用。

相分离特性促进Rga7和Rga8在细胞尖端的富集

为了探究相分离的生物学功能，研究人员通过定点突变，构建了相分离缺陷的突变体（Rga7-4A和Rga8-6A）。这些突变体虽然仍能定位于细胞膜，但其在细胞尖端的富集程度显著降低。此外，使用能够破坏相分离的化学试剂（如1,6-己二醇）处理细胞，也能破坏Rga7和Rga8在细胞尖端的富集。这些结果表明，相分离是Rga7和Rga8在细胞尖端富集的关键机制。

Rga8向细胞尖端的靶向运输依赖于肌动蛋白运输系统

研究人员进一步发现，Rga8向细胞尖端的定位依赖于肌动蛋白运输系统（包括肌动蛋白丝和马达蛋白Myo52），而Rga7的定位则独立于该系统。活细胞成像显示，Rga8在细胞质中形成点状结构，并沿着肌动蛋白丝被Myo52定向运输至细胞尖端，而相分离缺陷的Rga8突变体则失去了这种定向运输能力。

Rga7和Rga8的相分离是防止细胞裂解所必需的

最后，研究人员通过功能回补实验证明，表达野生型的Rga7或Rga8能够挽救双缺失细胞导致的裂解表型，而表达相分离缺陷的突变体则无法挽救。这直接证明了Rga7和Rga8的相分离特性对于维持细胞完整性是不可或缺的。

本研究首次揭示了F-BAR结构域本身具有液-液相分离的能力，为理解F-BAR蛋白如何通过形成生物分子凝聚体来调控细胞极性提供了全新的视角。研究结果表明，Rga7和Rga8通过相分离在细胞尖端形成一个功能性的“枢纽”，从而协同调控下游信号通路，确保细胞壁合成相关因子的精确定位，最终维持细胞完整性。这一发现不仅深化了我们对细胞极性建立和维持机制的理解，也为研究其他F-BAR蛋白的功能提供了新的思路。