EBNA1-YAP信号轴通过CD276驱动EBV相关胃癌免疫逃逸的机制与治疗意义

《Cell Death & Disease》：An EBNA1-YAP signaling axis drives immune escape through CD276 in EBV-associated gastric cancer

尽管抗PD1免疫疗法在部分肿瘤中效果显著，但其在EB病毒相关胃癌（EBVaGC）中的应答率较低。本研究通过转录组分析和免疫组化筛查，发现免疫检查点分子CD276（B7-H3）是独立的免疫抑制因子，与不良预后相关。机制上，EBV编码的EBNA1激活Hippo通路效应器YAP，YAP与转录因子TEAD4结合至CD276调控区直接上调其转录，促进T细胞凋亡并抑制免疫应答。人源化小鼠模型证明，CD276高表达导致抗PD1治疗耐药，而联合靶向CD276与PD1可显著抑制肿瘤生长。该研究揭示了EBVaGC免疫逃逸的新机制，为联合免疫治疗提供了理论依据。

　　

在消化系统恶性肿瘤中，胃癌的发病率和死亡率居高不下，尤其晚期患者生存期仅一年左右。癌症免疫治疗的出现，特别是程序性死亡受体1（PD-1）及其配体（PD-L1）抑制剂，为多种实体瘤带来了希望，但在胃癌中的应答率仍徘徊在10%左右，疗效不尽如人意。Epstein-Barr病毒相关胃癌（EBVaGC）是胃癌的一种独特分子亚型，其肿瘤微环境（TME）以大量免疫细胞浸润为特征，尤其是具有抗肿瘤活性的CD8⁺T细胞。理论上，这种免疫细胞丰富的"热肿瘤"应对免疫治疗敏感，但临床上EBVaGC患者对PD-1抑制剂的反应率差异巨大，很少超过30%，近半数病例甚至呈现免疫静止状态。这种免疫治疗抵抗现象背后的机制尚不明确，严重限制了患者从免疫治疗中获益。

针对这一临床挑战，研究人员对50例EBVaGC患者的肿瘤样本进行了转录组测序（RNA-seq）和免疫组化（IHC）分析，旨在系统探索EBVaGC中的免疫逃逸机制。研究发现CD276（也称为B7-H3）是一个独立且关键的免疫抑制分子。CD276在肿瘤组织中的表达显著高于癌旁正常组织，且高表达CD276与患者不良预后密切相关。在肿瘤微环境中，CD276高表达与T细胞和B细胞浸润减少相关，特别是在肿瘤侵袭边缘（IM）区域，CD8⁺T细胞和CD20⁺B细胞的浸润明显受限。体外实验表明，过表达CD276的胃癌细胞与活化Jurkat T细胞共孵育后，可诱导T细胞凋亡，并抑制其分泌干扰素-γ（IFN-γ）和白介素-2（IL-2）等关键细胞因子。在人源化小鼠模型中（通过给NOD-SCID IL2Rγ^null小鼠输注人外周血单核细胞PBMCs构建），CD276过表达加速了肿瘤生长，并减少了肿瘤内CD8⁺T细胞的浸润。对15例EBVaGC新鲜组织样本的流式细胞术分析进一步证实，CD276高表达肿瘤中浸润的CD8⁺T细胞其颗粒酶B（GZMB）、穿孔素（PRF）和IFN-γ的表达水平显著降低，表明其抗肿瘤功能受到抑制。

机制探索方面，基因集富集分析（GSEA）显示，YAP/TAZ/TEAD直接靶基因在CD276高表达组中显著富集。进一步实验证实，CD276的表达受Hippo信号通路关键效应分子YAP（Yes-associated protein）调控，而非其旁系同源物TAZ。YAP与转录因子TEAD4形成复合物，直接结合至CD276基因调控区的两个特异性位点（BS3和BS4），从而启动CD276的转录。染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）和后续的ChIP-qPCR、荧光素酶报告基因实验以及CRISPRi（CRISPR干扰）和CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术均验证了YAP/TEAD4对CD276的直接转录调控作用。重要的是，研究揭示了病毒蛋白在其中的驱动作用：EBV编码的核抗原1（EBNA1）能够激活YAP。EBNA1一方面通过直接结合至YAP基因的调控区域促进其转录，另一方面通过调控Hippo通路上游激酶MST1/2和LATS1/2，促进YAP去磷酸化和核转位，从而激活YAP信号。这构成了一条"EBNA1-MST1/2-LATS1/2-YAP-TEAD4-CD276"的全新信号轴。

临床转化方面，对7例接受纳武利尤单抗（nivolumab，抗PD-1抗体）治疗的EBVaGC患者的评估发现，疾病快速进展的两位患者其肿瘤组织均表现出高CD276表达和CD8⁺T细胞浸润减少。在人源化小鼠模型中，靶向CD276的药物（MGA271）与PD-1抑制剂（帕博利珠单抗，pembrolizumab）联合治疗显示出协同抗肿瘤效果，联合治疗组肿瘤体积最小，肿瘤内CD8⁺T细胞浸润最多，显著优于单药治疗组或对照组。

本研究主要关键技术方法包括：对临床样本（50例EBVaGC患者肿瘤及配对癌旁组织）进行转录组测序（RNA-seq）和生物信息学分析；免疫组化（IHC）进行蛋白定位和半定量；利用细胞系（如SNU-719, AGS, GT38）进行基因过表达、敲低、荧光素酶报告基因实验；染色质免疫共沉淀（ChIP）技术分析转录因子结合；CRISPR/Cas9系统进行基因编辑；建立人源化小鼠模型进行体内功能验证；流式细胞术分析免疫细胞等。

免疫浸润抑制功能与CD276在EBVaGC中的预后潜力

通过对50例EBVaGC肿瘤标本的转录组分析，结合免疫细胞浸润评估，发现CD276高表达与T细胞和B细胞浸润减少显著相关，是独立的免疫抑制风险因素。免疫组化进一步证实CD276高表达主要抑制肿瘤侵袭边缘的CD3⁺和CD8⁺T细胞浸润。生存分析显示CD276高表达患者无病生存期（DFS）更差，在多因素Cox回归模型中，CD276仍是独立预后因素。独立队列（GSE62254）验证了CD276高表达与更差的总生存期（OS）和DFS相关。

CD276在体外和体内的免疫抑制功能

体外共培养实验证明，CD276过表达诱导T细胞凋亡，减少T细胞数量，并抑制IFN-γ和IL-2分泌。在人源化小鼠模型中，CD276过表达加速肿瘤生长，并减少肿瘤内CD8⁺和CD20⁺免疫细胞浸润。临床新鲜组织流式分析显示，CD276高表达组中浸润CD8⁺T细胞的效应分子（GZMB, PRF, IFN-γ）表达降低，表明功能受抑。

YAP-TEAD4参与EBVaGC中CD276的转录上调

生物信息学分析显示YAP/TAZ/TEAD靶基因在CD276高表达组富集，且CD276表达与YAP1正相关。功能实验证实YAP（而非TAZ）正向调控CD276表达。TEAD4被鉴定为YAP的关键协同因子，ChIP-qPCR和报告基因实验证实YAP/TEAD4复合物直接结合于CD276调控区的BS3和BS4位点激活其转录。CRISPRi或CRISPR/Cas9编辑这些位点可显著降低CD276表达。YAP敲低或使用YAP-TEAD相互作用抑制剂（如verteporfin）处理，可减轻T细胞凋亡，增强细胞因子分泌，并在体内抑制肿瘤生长、增加CD8⁺T细胞浸润。

EBV编码的EBNA1介导YAP通路激活和CD276过表达

GSEA提示病毒转录正调控通路在CD276高表达组富集。EBV感染可诱导YAP表达。EBV编码的EBNA1与YAP和CD276蛋白水平呈正相关。过表达EBNA1可上调YAP表达并促进其核定位。ChIP-qPCR证实EBNA1可直接结合于YAP基因的调控位点。在蛋白水平，EBNA1通过影响Hippo通路激酶MST1/2和LATS1/2，促进YAP去磷酸化和活化。

CD276高表达损害EBVaGC患者抗PD1治疗效果

对7例接受抗PD1（nivolumab）治疗的EBVaGC患者的临床评估发现，疾病快速进展的患者其肿瘤呈现高CD276表达和低CD8⁺T细胞浸润，提示CD276介导的免疫抑制可能导致抗PD1耐药。

靶向CD276和PD1的联合疗法在EBVaGC异种移植模型中的效果

在人源化小鼠SNU719异种移植模型中，靶向CD276（MGA271）与抗PD1（pembrolizumab）的联合治疗相比单药或对照组，表现出最强的肿瘤生长抑制效果和最高的瘤内CD8⁺T细胞浸润，证明了联合治疗的优越性。

讨论与结论

本研究深入阐释了EBVaGC免疫抵抗的机制。研究发现CD276是EBVaGC中一个关键的免疫抑制分子，其表达受EBV病毒蛋白EBNA1驱动的Hippo-YAP信号轴调控。这条"EBNA1-YAP-CD276"信号轴促进了肿瘤的免疫逃逸，并可能导致对现有PD-1抑制剂治疗的抵抗。值得注意的是，CD276的调控独立于IFN-γ信号（这与PD-L1不同），提示其表达可能由肿瘤细胞内在特性驱动。靶向YAP-TEAD4-CD轴或联合使用CD276抑制剂与PD-1抑制剂，有望将免疫"冷"肿瘤转化为"热"肿瘤，增强抗肿瘤免疫力。该研究不仅揭示了EBVaGC免疫逃逸的新机制，也为改善该疾病免疫治疗疗效提供了新的联合治疗策略和潜在靶点。