靶向SMAD3/CISD2轴通过促进铁死亡抑制间质样膀胱癌进展

《Cell Death & Disease》：Targeting the SMAD3/CISD2 axis suppresses bladder cancer progression by promoting ferroptosis in mesenchymal-like bladder cancer cells

本研究针对肌层浸润性膀胱癌(MIBC)因上皮-间质转化(EMT)导致侵袭转移能力增强但治疗反应差的难题，揭示了TGF-β1诱导的EMT通过SMAD3/CISD2信号轴动态调控铁死亡敏感性的新机制。研究发现间质样膀胱癌细胞通过SMAD3转录激活CISD2维持铁代谢稳态，建立"氧化增强-抗氧化补偿"新平衡，使其对铁死亡诱导剂Erastin更敏感。体内外实验证实靶向该轴可显著抑制肿瘤生长，为MIBC提供了新的治疗靶点。

　　

膀胱癌是全球泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居全身恶性肿瘤第10位，死亡率排第13位，严重威胁患者生存。根据肿瘤浸润深度，膀胱癌可分为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。临床数据显示，NMIBC患者的5年生存率可高达90%，而MIBC患者的这一比率却骤降至40%-60%。这种显著的预后差异，不仅源于肿瘤浸润加深导致的手术难度增大和术后复发风险升高，更与MIBC对常规放化疗的抵抗以及当前靶向治疗方案的局限性密切相关。

上皮-间质转化(EMT)是驱动膀胱癌等实体瘤侵袭转移的核心生物学事件，表现出显著的异质性。EMT不仅通过下调E-钙黏蛋白(E-cadherin)等上皮标志物、激活波形蛋白(Vimentin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)等间质标志物，赋予肿瘤细胞迁移和侵袭能力，还能通过表观遗传和转录重编程重塑氧化还原稳态。在膀胱癌的动态肿瘤微环境(TME)中，EMT与基质成分（包括癌症相关成纤维细胞(CAFs)、免疫细胞和细胞外基质(ECM)重塑）相互作用，促进免疫抑制、血管生成和治疗抵抗。值得注意的是，TGF-β/Smad信号通路驱动的EMT进程可能通过重塑细胞内氧化还原稳态来影响细胞命运决定，这是膀胱癌恶性进展中的一个关键改变，但其精确调控机制仍未明确。

近年来，铁死亡(Ferroptosis)作为一种新型的程序性细胞死亡方式受到广泛关注，其特征是氧化还原稳态崩溃：铁依赖性的脂质过氧化物(LPO)积累和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)系统失活。值得注意的是，伴随EMT发生的氧化还原稳态重塑可能直接调节肿瘤细胞对铁死亡的敏感性。新兴研究表明，在乳腺癌和结直肠癌中，EMT通过多种机制显著增强肿瘤细胞的铁死亡敏感性。然而，在膀胱癌中，EMT介导的氧化还原系统重塑如何影响铁死亡反应，仍属未知。

这项发表在《Cell Death & Disease》上的研究，首次揭示了Smad3/CISD2信号轴在间质样膀胱癌细胞中调控铁死亡的机制。为了阐明EMT与铁死亡之间的复杂关系，Sun Yulin等人开展了一系列深入的研究。

研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术：收集临床膀胱癌组织样本进行免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)分析；使用TGF-β1处理膀胱癌细胞系(T24, 5637)建立上皮-间质转化(EMT)模型；通过RNA干扰(siRNA)和慢病毒载体介导的基因敲降技术调控SMAD3和CISD2的表达；采用RNA测序(RNA-seq)和染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)进行多组学分析，筛选下游靶点；利用细胞活力检测(CCK-8)、克隆形成、Transwell小室实验和划痕愈合实验评估细胞增殖、迁移和侵袭能力；通过流式细胞术、特异性荧光探针（如FerroOrange检测Fe²⁺，C11-BODIPY检测脂质过氧化）和生化试剂盒检测细胞内活性氧(ROS)、Fe²⁺、还原型谷胱甘肽(GSH)、脂质过氧化物(LPO)和丙二醛(MDA)水平；借助透射电子显微镜(TEM)观察线粒体超微结构；并最终通过裸鼠皮下异种移植瘤模型进行体内功能验证。

研究结果

EMT激活与膀胱癌进展及不良预后相关

对癌症基因组图谱(TCGA)数据库的分析显示，上皮标志物CDH1（编码E-cadherin）的mRNA表达随着临床分期的进展而逐渐降低，而间质标志物CDH2（编码N-cadherin）和VIM（编码Vimentin）的mRNA水平则升高。对临床样本的IHC和IF分析进一步证实，与NMIBC相比，MIBC组织中E-cadherin蛋白表达强度显著降低，而N-cadherin和Vimentin水平显著上调。生存分析表明，高CDH2和高VIM表达的患者总生存期显著缩短，而高CDH1表达则与较好的预后相关。这些发现强调了EMT激活在膀胱癌进展中的关键作用。

EMT与间质样膀胱癌细胞的铁死亡相关

通过TGF-β1诱导，研究人员成功在T24和5637膀胱癌细胞系中建立了EMT模型（命名为T24m和5637m）。这些细胞表现出典型的间质样形态和分子标志物转换，并且迁移和侵袭能力显著增强。有趣的是，在EMT过程中，铁死亡相关基因呈现动态变化：抗铁死亡的核心基因GPX4、SLC7A11和FTH1的mRNA和蛋白水平随TGF-β1浓度增加而上调，同时促铁死亡基因FACL4也同步升高。生化检测发现，间质样膀胱癌细胞的LPO水平和GSH水平均显著升高，表明细胞通过协调增强氧化应激反应和抗氧化防御，建立了一种动态平衡的氧化还原微环境。

间质样膀胱癌细胞对铁死亡表现出更高的敏感性

用低浓度铁死亡诱导剂Erastin处理细胞后发现，间质样膀胱癌细胞(T24m)的存活率受到显著抑制，而上皮样细胞(T24)在相同条件下存活率下降不明显。FerroOrange铁染色显示，Erastin处理的间质样细胞内有更明显的Fe²⁺积累。流式细胞术检测表明，低剂量Erastin诱导间质样细胞产生显著更高的总细胞内ROS水平。同时，间质样细胞在Erastin诱导下表现出更明显的细胞内GSH耗竭，以及更高的LPO和MDA水平。C11-BODIPY荧光染色结果与生化检测一致。这些结果证实，经历EMT的间质样膀胱癌细胞对铁死亡诱导剂更敏感。

Smad3是调控膀胱癌细胞铁死亡的关键枢纽

RNA-seq分析发现，在用铁死亡诱导剂（Erastin和RSL3）处理的间质样膀胱癌细胞中，转录因子Smad3的表达显著下调。RT-qPCR、Western blot和IF染色验证了Erastin处理能降低Smad3及其磷酸化形式(p-Smad3)的蛋白水平和核定位。通过siRNA敲降Smad3后，间质样细胞中促铁死亡基因FACL4上调，而抗铁死亡基因GPX4、SLC7A11和FTH1下调。功能上，Smad3敲降显著降低了间质样细胞的活力，这种效应可被铁死亡抑制剂Fer-1逆转。Smad3敲降还导致细胞内Fe²⁺、ROS、LPO和MDA水平升高，GSH水平降低，并引发典型的铁死亡线粒体超微结构改变（如线粒体体积减小、膜电子密度增加、嵴结构破坏）。值得注意的是，Smad3敲降在上皮样膀胱癌细胞中未能诱导显著的铁死亡相关变化，提示EMT建立的氧化还原新稳态是Smad3调控铁死亡敏感性的前提。

Smad3敲降通过铁死亡抑制膀胱癌细胞迁移、侵袭和增殖

功能实验表明，Smad3敲降显著抑制了间质样膀胱癌细胞的迁移（划痕愈合实验）和侵袭能力（Transwell实验），并且这种抑制可被Fer-1部分逆转。克隆形成实验显示Smad3敲降抑制了细胞增殖。流式细胞术分析证实Smad3敲降增加了间质样细胞的死亡。

多组学分析确定CISD2是Smad3调控铁死亡的直接下游靶点

整合RNA-seq、ChIP-seq和铁死亡相关基因集的分析，将候选基因缩小至4个，其中包括关键的铁硫簇生物合成调控因子CISD2。ChIP-seq分析显示，p-Smad3结合峰有30.68%富集在启动子区的转录起始位点(TSS)附近，并在CISD2启动子区检测到显著的结合信号。TCGA数据库临床相关性分析显示，膀胱癌组织中Smad3与CISD2的mRNA表达呈正相关。CISD2在肿瘤组织中的表达显著高于正常膀胱组织，且随临床分期进展而上调。预后分析表明，高CISD2表达患者无病生存期显著缩短。实验验证表明，Smad3敲降显著抑制了CISD2的mRNA和蛋白水平。临床样本的IF和IHC染色证实，在MIBC组织中Smad3和CISD2蛋白表达均高于NMIBC组织，且存在共表达模式。

Smad3通过CISD2调控间质样膀胱癌细胞的铁死亡

在Smad3敲降的间质样膀胱癌细胞中过表达CISD2，能够显著逆转由Smad3敲降引起的细胞活力下降。CISD2过表达还能有效降低细胞内Fe²⁺水平，减弱ROS生成，提升GSH含量，并显著抑制Smad3敲降诱导的LPO和MDA积累。C11-BODIPY荧光染色和TEM观察进一步证实，CISD2过表达挽救了Smad3敲降导致的脂质过氧化加剧和线粒体超微结构异常。这些结果从多个维度证实CISD2是Smad3调控铁死亡的关键下游效应分子。

靶向Smad3/CISD2轴在体内诱导间质样膀胱癌细胞铁死亡

体内实验显示，与对照组相比，稳定敲降Smad3的异种移植瘤体积和重量显著减小，而联合使用Fer-1可部分逆转这种肿瘤生长抑制。IHC染色表明，shSmad3肿瘤组织中，铁死亡抑制蛋白GPX4表达降低，脂质过氧化标记物4-HNE表达增加，增殖标志物Ki-67阳性率降低，且CISD2蛋白水平显著下降，Fer-1处理可逆转这些变化。这从体内证实了Smad3敲降通过抑制CISD2介导的铁死亡来抑制膀胱癌的生长和进展。

结论与意义

本研究通过多组学分析和功能验证，首次阐明膀胱癌细胞中核心EMT调控因子Smad3不仅能驱动EMT，还能转录激活CISD2以维持线粒体铁稳态和抗氧化防御，从而建立一种"氧化增强-抗氧化补偿"的动态平衡，最终增强细胞对铁死亡的敏感性。机制上，Smad3-CISD2轴是连接EMT与铁死亡调控的特定分子桥梁——Smad3通过调控CISD2表达，将EMT诱导的氧化应激转化为铁死亡敏感性的改变。该研究创新性地提出了EMT过程中"氧化-抗氧化双相平衡"模型，揭示了Smad3/CISD2信号轴作为调控铁死亡的关键节点。这一发现不仅深化了对膀胱癌侵袭转移机制的理解，更重要的是，为针对MIBC（其特征通常是EMT激活和治疗抵抗）开发通过破坏氧化还原平衡来特异性诱导铁死亡的靶向治疗策略提供了新的理论依据和潜在的干预靶点，具有重要的转化医学价值。未来的研究可聚焦于开发针对Smad3-CISD2轴的靶向策略，用于MIBC的个性化治疗。