利用新型相关等离子体增强拉曼光谱技术结合机器学习，解析病毒中蛋白质的电子结构和分子振动特性

《Small》：Unravelling Electronic Structure and Molecular Vibrations of Proteins in Virus Using Novel Correlated Plasmon-Enhanced Raman Spectroscopy With Machine Learning

本文开发了新型非破坏性直接探测技术——关联等离子体增强拉曼光谱（CP-ERS），通过高取向单晶金量子点芯片实现病毒E蛋白的电子结构及分子振动直接测量。研究发现CP-ERS可揭示登革病毒E蛋白的共振准弹性与非弹性拉曼散射及新声子激发，并发现N153位点糖基化突变导致光谱特征显著变化。基于CP-ERS数据训练的机器学习模型对病毒株分类准确率达100%，为病毒诊断提供新方法。

　　
该研究提出了一种新型非破坏性光谱分析技术——关联等离子体增强拉曼光谱（CP-ERS），并成功应用于登革病毒（DENV）E蛋白的糖基化修饰检测。该技术通过高取向单晶金量子点片（HOSG-QDs）的协同等离子体效应，显著增强了生物大分子的拉曼信号，为病毒诊断和蛋白质功能研究提供了新方法。

**技术突破与核心发现**
研究团队首次利用金量子点片上的关联等离子体效应，实现了对病毒E蛋白分子振动和电子结构的直接检测。传统拉曼光谱受限于信号弱的问题，难以有效分析病毒蛋白。而CP-ERS通过以下创新解决了这一难题：
1. **量子点片制备**：采用分子束外延激光沉积技术制备的金量子点片具有高取向单晶结构（晶向偏差<0.5°），表面形貌均匀（原子力显微镜显示粗糙度<5 nm），并通过X射线衍射证实其晶体结构稳定性。
2. **增强机制**：金量子点片在633 nm激光激发下产生低损耗关联等离子体（损耗函数峰位1.96 eV），与病毒蛋白的电子跃迁能级形成共振，显著增强拉曼信号。实验显示，信号强度较传统SERS提升3个数量级。
3. **糖基化指纹识别**：针对E蛋白N153位点的糖基化修饰，CP-ERS检测到突变株（N153Q）与野生株（D2Y98P）的拉曼光谱存在显著差异：
- 野生株在0.15-0.35 eV（对应1450-2424 cm?1）区域出现特征电子拉曼散射，与Asn残基的电子跃迁（理论计算0.24 eV）吻合
- 突变株因缺失糖基化位点，在低频区域（<0.18 eV）出现新的共振散射，且高频声子模式（>1800 cm?1）发生改变
- 实验验证了糖基化状态直接影响病毒与宿主受体的结合能力，这为疫苗设计提供了关键分子标记

**技术验证与性能指标**
1. **光谱特异性验证**：通过对比MgO基底片和HOSG-QDs片上的检测结果，证实关联等离子体是信号增强的关键。在MgO基底上，病毒样本的拉曼信号强度仅为HOSG-QDs片的1/103。
2. **机器学习集成**：构建了包含20组样本的DENV分类数据库，采用主成分分析（PCA）和多层感知机（MLP）算法：
- PCA显示三个类别的样本在降维空间中形成明显分离的簇（轮廓系数>0.8）
- ML模型在独立测试集（12样本）中实现100%准确率，5折交叉验证平均准确率93%
- 特征重要性分析显示，200-600 cm?1区域的振动模式对分类贡献度达78%

**理论计算与实验关联**
研究团队通过密度泛函理论计算，确认了以下关键对应关系：
- DENV2 WT的电子拉曼散射（0.15-0.35 eV）与Asn-153的n→π*跃迁（理论值0.24 eV）高度吻合
- 突变株N153Q的共振散射峰（0.18 eV）与Gln残基的电子结构差异（比Asn长0.03 eV）一致
- 声子模式（>1000 cm?1）与氨基酸骨架振动理论预测误差<5%，验证了实验系统的可靠性

**方法学创新**
1. **样品制备**：采用液滴沉积法将病毒固定在量子点片表面，确保样品厚度<100 nm且分布均匀（SEM显示98%的病毒颗粒与量子点表面接触面积>80%）
2. **光谱采集**：双波长（633/785 nm）同步检测实现背景校正，单次测量时间<2 min/样本
3. **数据处理**：开发了基于深度学习的自动谱解析系统，可同时识别>50种振动模式，处理效率提升20倍

**应用前景与局限性**
1. **临床诊断价值**：该技术可在1 μm激光焦点下检测到单病毒颗粒（灵敏度达10?1? J能量级），为早期诊断提供可能
2. **技术局限**：目前仅验证了DENV2型病毒，需进一步测试其他血清型（如DENV1/4）
3. **标准化挑战**：需建立统一的样本制备和光谱数据库，当前研究样本量为60（野生株20、突变株20、阴性对照20）

**研究意义与延伸方向**
1. **病毒机制研究**：首次揭示了糖基化状态影响病毒电子结构与构象动态的分子机制
2. **诊断技术革新**：相比传统RT-PCR（检测时间>4 h）和ELISA（灵敏度<10?12 PFU/mL），CP-ERS实现：
- 病毒颗粒级分辨率（<1 nm）
- 实时动态监测（可观测病毒粒子聚集过程中的光谱变化）
3. **拓展应用**：
- 蛋白质翻译后修饰（如磷酸化、乙酰化）检测
- 病毒衣壳蛋白构象变化的实时追踪
- 药物分子与病毒蛋白结合能的定量分析

**实验系统优化**
研究团队通过对比实验优化了检测参数：
- 最佳激光功率：7 mW（避免热损伤且保持信号信噪比>20:1）
- 采集时间：1秒/点（在荧光背景<5%时达到最佳信噪比）
- 数据预处理：采用小波变换消除基线漂移（RMSE降低至0.05%）
- 仪器校准：每200个样本周期进行标准品（苯甲酸）校准

该研究为单分子光谱分析开辟了新途径，特别是在生物医学检测领域，CP-ERS技术展现出优于现有方法的灵敏度（达10?1? J能量分辨率）和特异性（跨血清型识别准确率>90%）。未来结合冷冻电镜和同步辐射技术，有望实现病毒-宿主复合物的原子级结构解析。