《Journal of Chromatography A》：Decoding diastereomeric and impurity profiles of phosphorothioated siRNAs via 2D anion-exchange chromatography coupled with ion-pair reversed phase liquid chromatography mass spectrometry
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磷酸硫代酯（PS）修饰寡核苷酸（ONs）的立体异构体分离研究。采用阴离子交换色谱（AEX）结合多步骤负梯度优化，成功实现21-mer ONs中8种PS异构体的基线分离。研究揭示了AEX分离机制不仅依赖净电荷，更与立体异构体表面电荷分布差异相关。通过联用质谱技术，完成了含N-乙酰氨基半乳糖胺或棕榈酰酰胺修饰的siRNA双链及其单链的立体异构体和杂质分析。
作者：Quang-Dong Bui、Willy Verluyten、Bart Noten、Tiny Deschrijver、Sebastiaan Eeltink
比利时布鲁塞尔自由大学（VUB）化学工程系，邮编1050，布鲁塞尔
摘要
磷酸硫酯（PS）修饰广泛应用于基于RNA的治疗性寡核苷酸（ONs）中，这些修饰可以形成非对映体，从而提高ONs的稳定性、生物利用度和细胞摄取能力。本研究提出了一种利用阴离子交换色谱（AEX）技术分析PS-ONs的方法，包括双链结构及其相应的单链和反义链成分。通过AEX分析研究了PS修饰数量和位置的变化、核糖修饰以及碱基组成对PS修饰五聚体ONs的影响。保留行为通过Boardman和Patrick模型进行了详细表征。尽管各种非对映体在吸附-解吸过程中涉及的电荷数量相似，但它们可以通过独特的表面电荷区域进行区分。系统评估了pH值、柱温、反离子和置换离子以及颗粒大小等参数，以优化非对映体的分离效果。优化后的多步骤负梯度分离方法能够从含有3个PS修饰的21聚体ON中分离出8种非对映体。通过多次心脏切割AEX-IP-RPLC-MS 2D分析，对N-乙酰半乳糖胺修饰的双链ON和棕榈酰胺修饰的小干扰RNA的非对映体进行了分析。与非共轭ONs不同，离子型 conjugates的存在使得1D AEX色谱图中仅出现两个非对映体峰。在2D IP-RPLC分析过程中，每种小干扰RNA的非对映体组分发生变性，从而实现了反义链和正义链的分离，为后续的质谱检测提供了纯度分析的基础。
引言
寡核苷酸（ONs）已成为治疗多种基因相关疾病（包括癌症、自身免疫性疾病和神经系统疾病）的有前景的药物类别[1]。截至目前，已有23种治疗性ONs获得了FDA的批准。ONs的主要结构是由亲水性的负电荷核糖-磷酸骨架组成，核糖单元上连接着不同的核碱基。由于ONs的亲水性和多阴离子性质，它们难以穿过细胞膜，从而限制了其治疗效果[2]。在细胞外环境中，ONs会被核酸酶迅速降解并通过肾脏清除。通过引入多种化学修饰，这些限制得到了很大程度的克服[3,4]。磷酸硫酯（PS）是最常用的修饰方式之一。当用硫原子取代磷酸单元中的非桥接氧原子时，会形成两种非对映体。对于含有n个PS修饰的ONs，形成的非对映体总数为2n，这显著增加了样品的复杂性，并可能导致非对映体之间出现不同的治疗效果。将长链非离子化合物（如脂肪酸和N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）与ONs结合，对于提高组织靶向性至关重要。最新研究强调了亲脂性siRNA conjugates在向中枢神经系统和眼部组织高效选择性递送方面的潜力[5]。此外，脂质修饰的寡核苷酸（特别是N3′→P5′硫代磷酸酰胺修饰的ONs）在癌症研究中作为改善端粒酶抑制剂药效的策略正得到广泛应用[6,7]。N-乙酰半乳糖胺修饰的ONs技术已成为靶向肝脏肝细胞的有效递送方法[1]。传统的固相合成方法常会产生多种结构相关杂质，例如磷酸二酯（PO）类似物和链长变体（如n?1和n+1物种），从而显著增加最终产物的复杂性[8]。
目前用于PS-ONs（包括非对映体和杂质）分离的最有效方法包括离子对（IP-）RPLC[9]、阴离子交换色谱（AEX）[10,11]、结合AEX和RPLC选择性的混合模式色谱[12]、亲水相互作用色谱（HILIC）[13]以及毛细管电泳[14,15,16]。在IP-RPLC中分离非对映体具有挑战性，因为用作离子配对剂的烷胺可能导致多种不同的色谱相互作用。此外，双链水平上的非对映体分析常因变性而受到影响。混合模式色谱通过利用电荷、极性和疏水性的差异提供了高灵活性，但方法开发可能耗时且复杂。AEX在ONs的分离和纯化方面具有高选择性，依赖于分子电荷相互作用。利用AEX已成功分离出最多四个非对映体（对应于两个PS修饰）。此外，AEX是一种非变性技术，能够保持双链结构。然而，对于电荷相似的杂质，其分离能力有限，且流动相组成与质谱检测不兼容[18]。尽管已研究了多种AEX色谱参数用于ONs和杂质的分离，但其对非对映体分析的具体影响仍需进一步探索，尤其是对于离子型 conjugated ONs。
在本研究中，我们系统地研究了影响磷酸硫酯寡核苷酸AEX选择性的因素，包括单链和双链水平。使用具有不同PS数量和位置、不同碱基及核糖修饰的模型五聚体ONs，评估了流动相pH值、柱温和离子盐的影响。接下来，研究了AEX对21聚体ONs非对映体分析的分离能力，并探讨了多步骤负梯度方法的附加价值。最后，将AEX方法与高通量IP-RPLC-MS结合使用，用于分析多种conjugated-siRNA非对映体及其杂质。
材料与化学品
1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇、三乙胺、乙酸钠、氯化钠和溴化钠购自Sigma-Aldrich（德国Steinheim）。乙腈（ACN，HPLC超梯度质量）购自Biosolve（荷兰Valkenswaard）。去离子水（≤ 0.055 μS）使用Milli-Q梯度水纯化系统（Millipore，法国Molsheim）自制。2’修饰的RNA序列包含2’-氟（F）、2’-甲氧基（m）、2’-甲氧基乙基等修饰
PS修饰ONs的AEX保留机制解析
在AEX模式下，评估了具有不同PS修饰数量和位置、糖修饰以及不同碱基组成的五聚体ONs的保留行为。PS修饰会导致非对映体的形成，形成Sp和Rp构型，如图1A中的mC5-2（第二个位置有一个PS修饰的五聚体ON）所示。图1B展示了改变PS修饰数量时的色谱图。
结论
本研究展示了AEX在分析ONs非对映体谱型方面的潜力。在保持非对映体构型的同时，发现AEX的保留机制不仅受净电荷影响，还受各非对映体独特表面电荷区域的影响，这有助于它们的色谱分离。通过应用优化的柱温和定制的多步骤梯度程序，我们成功实现了分离。
CRediT作者贡献声明
Quang-Dong Bui： 数据分析、数据整理、概念构思。Willy Verluyten： 文章撰写、审阅与编辑。Bart Noten： 文章撰写、审阅与编辑。Tiny Deschrijver： 文章撰写、审阅与编辑。Sebastiaan Eeltink： 文章撰写、审阅与编辑、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢创新与创业机构（VLAIO）提供的资助（项目编号HBC.2021.1125）。同时感谢Hans Thys和Nikolett Wittner（Janssen Research & Development，Johnson & Johnson公司，比利时Beerse）提供的技术支持和仪器使用便利。
