Lrs14家族蛋白Sul14a作为古菌染色体组织关键调控因子的多尺度功能解析

《Communications Biology》：An Lrs14 family protein functions as a nucleoid-associated protein regulating cell cycle progression in Sulfolobales

本研究针对硫化叶菌目古菌染色体动态组织机制不明的问题，通过整合遗传学、生物化学、ChIP-seq、Hi-C和转录组学技术，发现Lrs14家族蛋白Sul14a作为一类新型的类核相关蛋白(NAP)，其细胞周期依赖性表达通过调控染色质区室化和全局转录，协调古菌有序的细胞周期进程。该研究揭示了Sul14a在维持基因组三维结构和基因表达时序性中的核心作用，为理解古菌染色体组织机制提供了重要见解。

　　

在生命演化的漫长画卷中，古菌作为一类独特的生命形式，其细胞内部运作机制始终吸引着科学家们的探索目光。尤其是硫化叶菌目古菌，它们展现出与真核生物相似的细胞周期，具有明确的G₁、S、G₂、M和D（分裂）期，因此成为研究真核生物特征起源与分子机制的理想模型。然而，一个核心谜团始终悬而未决：这些结构简单的微生物，在缺乏组蛋白同源物的情况下，是如何动态地组织其染色体结构，并协调基因表达以驱动细胞周期有序进行的？染色体组织的重任主要落在了一类称为类核相关蛋白（NAP）的小分子量、高丰度染色质蛋白身上。尽管此前已鉴定出Cren7、Sul7d等若干NAP，但硫化叶菌目基因组编码的多个Lrs14家族蛋白的功能，特别是它们在细胞周期进程中的角色，仍笼罩在迷雾之中。

为了揭开这一谜题，山东大学微生物技术国家重点实验室沈玉龙和黄启洪团队在《Communications Biology》上发表了最新研究成果。研究人员将目光聚焦于冰岛糖硫菌（Saccharolobus islandicus）REY15A中的一种Lrs14家族蛋白——Sul14a。通过一系列精巧的实验设计，他们发现Sul14a的转录呈现明显的细胞周期依赖性，但其蛋白水平在整个周期内却保持相对稳定。基因敲除尝试的失败暗示该基因可能是细胞存活所必需的。定量分析显示，每个细胞含有约1.8×10⁴个Sul14a单体，其与基因组DNA的质量比高达1.5:1，这为其作为主要NAP提供了有力证据。

在生化特性方面，研究表明Sul14a在溶液中形成二聚体，并能非特异性结合DNA，且对AT富集序列表现出明显的偏好性，其解离常数（K_d）为0.375 ± 0.047 μM。更关键的是，Sul14a展现出强大的DNA桥接能力，能够连接不同拓扑结构的DNA分子，这表明它可能通过介导DNA分子间的相互作用在染色质高级结构中发挥组织者功能。通过定点突变，研究人员进一步确认了其翼状螺旋-转角-螺旋（wHTH）结构域中精氨酸80（R80）和精氨酸90（R90）是DNA结合的关键残基。

由于无法获得敲除株，研究团队构建了Sul14a过表达菌株以探究其功能。结果发现，过表达野生型Sul14a会严重抑制细胞生长，并导致细胞周期阻滞在G₂期；而DNA结合缺陷型突变体的过表达则无此效应，证明该表型严格依赖于其DNA结合/桥接活性。这提示细胞可能通过精确调控Sul14a的活性来确保细胞周期的正常推进。

为了深入理解Sul14a的作用机制，研究人员进行了全基因组范围的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析。结果显示，Sul14a广泛富集于染色体上，且其富集程度与基因组区域的AT含量呈显著正相关（Spearman r = 0.66–0.83）。特别值得注意的是，Sul14a在基因转录起始位点（TSS）近端和具有最高平均AT含量的收敛基因间区域显示出最强的结合信号。过表达Sul14a会导致其结合模式发生改变，向启动子近端区域偏移。

高通量染色体构象捕获（Hi-C）分析揭示了Sul14a过表达对染色质三维结构的深远影响。与对照细胞相比，过表达细胞中特征性的棋盘格状相互作用模式变得模糊，染色质区室（A/B区室）的界限不清，且远距离的染色质相互作用显著增加。这表明Sul14a的异常高表达破坏了更高层次的染色体架构。更有趣的是，在同步化的细胞中，比较Sul14a转录低谷期（同步化后1小时）和高峰期（同步化后5小时）的染色质结构，也观察到了类似但程度较轻的变化趋势，暗示生理条件下Sul14a的周期性表达波动同样伴随着染色质区室化的动态重组。

转录组学分析将染色质结构变化与基因表达调控直接联系起来。Sul14a过表达引起了全局性的转录重编程，超过60%的注释基因表达发生超过2倍的变化。尤为显著的是，原本活跃转录的A区室基因表达普遍受到抑制，而相对不活跃的B区室基因则被激活。在生理性的细胞周期进程中，Sul14a转录高峰期也观察到了B区室基因转录上调的趋势，这与过表达实验的结果相呼应，进一步强化了Sul14a在协调区室特异性基因表达中的作用。

主要技术方法

本研究综合利用了分子遗传学（基因过表达株构建、细胞周期同步化）、生物化学（蛋白质纯化、EMSA、DNA桥接实验）、细胞生物学（流式细胞术）、蛋白质免疫印迹（Western blotting）以及多种组学技术（ChIP-seq、RNA-seq、Hi-C）。实验主要使用冰岛糖硫菌REY15A的E233S工程菌株（ΔpyrEFΔlacS）作为模型。关键实验技术包括利用阿拉伯糖诱导系统实现Sul14a的条件性过表达，通过乙酸处理实现细胞G₂期同步化，采用基于免疫沉淀的全基因组DNA结合位点分析（ChIP-seq），以及通过高通量染色体构象捕获（Hi-C）技术解析染色质三维结构动态。

Sul14a是细胞周期依赖性转录且细胞存活所必需的

研究人员通过乙酸处理同步化冰岛糖硫菌细胞，发现sul14a基因的转录水平在细胞周期中动态变化，从G₂期释放后1小时开始上升，至5小时达到峰值，随后下降。然而，其蛋白水平在整个周期内保持相对稳定。基因敲除实验的多次失败表明sul14a很可能是必需基因。定量Western blotting分析显示，每个细胞含有约1.8×10⁴个Sul14a单体，其与DNA的质量比高达1.5:1，远超已知的染色质蛋白Cren7（0.8:1），这从丰度上支持了Sul14a作为主要NAP的角色。

Sul14a优先结合AT富集DNA并具DNA桥接活性

体外实验证实，纯化的Sul14a蛋白形成二聚体，并能非特异性结合线性及环状质粒DNA。重要的是，它表现出对AT富集DNA序列的显著偏好，结合亲和力远高于GC富集序列。通过荧光标记的DNA pull-down实验，证明Sul14a能够桥接不同的DNA底物，包括线性双链DNA和不同拓扑构型的质粒DNA。这种桥接活性依赖于其DNA结合能力，因为DNA结合缺陷型突变体（R80A/R90A）完全丧失了桥接功能。结构预测显示，其N端的wHTH结构域负责DNA识别，而C端的卷曲螺旋结构域可能介导蛋白质寡聚化。

Sul14a过表达损害细胞增殖与细胞周期进程

由于敲除株构建失败，研究团队构建了Sul14a过表达菌株。在诱导条件下，sul14a的转录本水平升高了25-40倍，但蛋白水平仅增加约3倍。过表达野生型Sul14a严重抑制了细胞在诱导培养基中的生长，而DNA结合缺陷型突变体的过表达则不影响生长。流式细胞术分析显示，过表达导致非同步化细胞中单染色体（1C）群体完全消失，细胞阻滞在双染色体（2C）状态。对G₂期同步化细胞的进一步分析证实，Sul14a过表达阻断了染色体分离和/或细胞分裂，使细胞持续停滞在G₂期。

Sul14a在体内优先结合AT富集区域

细胞分级实验表明Sul14a主要定位于染色质部分。ChIP-seq分析揭示，Sul14a在染色体上广泛分布，在对照和过表达细胞中分别鉴定出780和802个高置信度富集峰。这些峰超过80%位于启动子近端区域。Sul14a的富集信号与基因组区域的AT含量高度正相关。比较不同基因组区域（TSS近端、基因体中段、收敛基因间区）的结合模式发现，具有最高AT含量的收敛基因间区结合最强且最均匀。过表达导致Sul14a在收敛基因间区的富集减弱，而在启动子近端的结合显著增强。

Sul14a过表达导致深刻的染色质区室化改变

Hi-C分析显示，对照细胞的染色质接触矩阵呈现清晰的棋盘格模式，反映了A/B区室的存在。而Sul14a过表达细胞中，该模式边界模糊，沿主对角线的染色质相互作用明显减弱。区室分析表明，过表达导致A/B区室的组成模糊化，并伴有区室间的相互转换。相互作用频率分析进一步揭示，过表达削弱了区室内的相互作用（A-A, B-B），但增强了区室间的长程相互作用（A-B）。

sul14a转录高峰与低谷期的染色质区室化分析

比较sul14a转录低谷期（SC-1h）和高峰期（SC-5h）的Hi-C数据发现，染色质区室边界在低谷期相对弥散，在高峰期则变得更为清晰，整体模式更接近异步生长的对照细胞。SC-5h与SC-1h的相互作用比率矩阵显示，从低谷期到高峰期，染色质接触模式的变化趋势与Sul14a过表达所观察到的相似，即中短程相互作用减弱，长程相互作用增加，但变化幅度较小。这表明生理性的sul14a转录波动伴随着染色质区室化的动态微调。

Sul14a表达升高影响全局转录及其染色体定位

转录组分析表明，Sul14a过表达导致全局转录重编程，A区室基因转录普遍受到抑制，而B区室基因转录则被激活。在细胞周期中，sul14a转录高峰期也观察到了B区室基因上调的趋势。比较ChIP-seq信号发现，过表达条件下Sul14a在全基因组的富集分布发生改变，特别是在转录活性升高的B区室（~0.5 Mb处）出现了一个明显的富集减弱区域，暗示局部染色质重组可能影响其结合。

研究结论与意义

本研究通过多尺度整合分析，确立了Sul14a是硫化叶菌目中一个新型的、与细胞周期相关的必需NAP。它通过其DNA结合和桥接活性，在维持基因组稳定性和高级染色体结构中扮演核心角色。Sul14a通过优先结合AT富集区域（特别是启动子近端和收敛基因间区），不仅局部影响启动子活性，更全局性地调控染色质可及性和区室化，从而协调细胞周期进程中的基因表达程序。其转录水平的周期性波动，可能通过尚未完全阐明的翻译后修饰（如磷酸化）调控其染色质结合活性，进而精细调节染色质动态。Sul14a的异常高表达会破坏染色质构象和区室完整性，导致G₂期阻滞，凸显了对其活性进行精确调控的重要性。

该研究首次将Lrs14家族蛋白的功能与古菌染色质三维结构动态和细胞周期调控直接联系起来，深化了对古菌染色体组织机制的理解。鉴于硫化叶菌目古菌在生命演化研究中的重要地位，这些发现也为探索真核生物染色质组织机制的起源提供了新的线索。未来，解析Sul14a与其他已知NAP（如Cren7、Sul7d）的功能协作关系，以及探究其活性如何被翻译后修饰调控，将是揭示古菌染色体组织全貌的关键下一步。