DNA修复通路蛋白Polθ通过微同源末端连接机制介导家蚕微环DNA eccDNAfib-L环化步骤的机制研究

《Communications Biology》：DNA repair pathway-related proteins are involved in the circularization step of microDNA eccDNAfib-L

本研究揭示了家蚕微环DNA eccDNAfib-L的形成机制：DNA聚合酶θ（Polθ）通过其DExH-box解旋酶结构域识别断裂点两侧的短直接重复序列"GAGT"，以微同源末端连接（MMEJ）方式介导线性DNA环化。该发现不仅阐明了eccDNA生物发生的关键分子途径，还为理解基因组不稳定性提供了新视角。

　　

在真核细胞中，存在着大量染色体外的环状DNA分子，它们像幽灵一样游离于染色体之外，因此被称为外染色体环状DNA（eccDNA）。这些神秘的环状DNA分子早在20世纪60年代就首次在小麦胚胎和公猪精子中被电子显微镜观察到。随着二代测序技术和生物信息学的发展，科学家们在越来越多的生物体中发现了eccDNA的存在。研究表明，eccDNA与肿瘤发生和衰老等多种生物学过程密切相关，例如可以通过增加癌基因拷贝数、促进癌基因扩增等方式增强肿瘤的可塑性和不稳定性。此外，eccDNA还具有转录活性，能够作为增强子增强基因表达。然而，尽管eccDNA的重要性日益凸显，其形成机制却一直是个未解之谜。

家蚕作为一种重要的鳞翅目模式生物，其丝腺是合成蛋白质的高效器官。先前研究通过对家蚕后丝腺进行eccDNA测序，发现了35,346种eccDNA，其中一种大小为542bp的微环DNA引起了研究人员的特别关注。这种被命名为eccDNA^fib-L的环状DNA来源于家蚕14号染色体的9,692,083-9,692,624核苷酸区域，携带部分丝心蛋白轻链（Fib-L）基因序列。有趣的是，在eccDNA^fib-L的5'和3'断裂点两侧都存在"GAGT"短直接重复序列，但形成的环状DNA中只保留了一个"GAGT"拷贝。功能分析表明，eccDNA^fib-L是Fib-L基因表达的正调控因子，但其形成机制尚不清楚。

为了解开这一谜题，研究人员开展了一系列精巧的实验。他们首先设计了一系列包含eccDNA^fib-L序列但侧翼长度不同的线性DNA片段（mini-200、mini-150、mini-100和mini-50），并将其转染到不同的细胞系中。令人惊讶的是，无论是在昆虫Sf9细胞、草鱼CIK细胞、人卵巢癌COV362细胞还是家蚕BmN细胞中，都能检测到与家蚕eccDNA^fib-L相同的特异性连接位点，表明eccDNA形成的环化步骤在不同细胞类型中是保守的。更重要的是，研究人员发现eccDNA^fib-L的形成效率与侧翼序列长度密切相关，且断裂点两侧的短直接重复序列"GAGT"对其形成至关重要。

当研究人员用紫外线照射或依托泊苷处理细胞诱导DNA损伤和凋亡时，发现eccDNA^fib-L的丰度显著增加，这表明DNA损伤和凋亡可能促进了eccDNA的形成。然而，在家蚕幼虫阶段，凋亡仅在丝腺发育的晚期（游走期）被激活，而eccDNA^fib-L的丰度随着丝腺发育而增加，提示凋亡可能不是丝腺中eccDNA^fib-L形成的关键因素。

通过RNA干扰技术沉默与微同源末端连接（MMEJ）通路相关的基因，包括XRCC1、Fen1、Polθ和Lig3，研究人员发现eccDNA^fib-L的形成显著减少。DNA pull-down实验进一步鉴定出多种与eccDNA^fib-L形成相关的DNA修复通路蛋白，如Ku蛋白、APE、Cdc5L和Polθ等。特别值得注意的是，沉默PARG基因反而促进了eccDNA^fib-L的形成。

在众多MMEJ相关基因中，DNA聚合酶θ（Polθ）对eccDNA^fib-L形成的影响最为显著。为了确认Polθ的作用，研究人员构建了Polθ表达载体，并在细胞游离反应体系中进行了深入研究。结果发现，只有当线性DNA片段两端都带有短直接重复序列时，Polθ才能介导其环化。当加入Polθ抑制剂ART558后，环化反应被抑制，进一步证实了Polθ的关键作用。

更深入的研究发现，Polθ的DExH-box解旋酶结构域在eccDNA^fib-L环化过程中扮演了核心角色。该结构域能够解旋双链DNA，搜索微同源序列并使5'和3'短重复序列退火，形成"缺口闭合环"中间体，从而启动eccDNA^fib-L的形成。此外，研究还表明DNA连接酶参与了eccDNA^fib-L形成的最后步骤，负责密封由Polθ介导的MMEJ过程中产生的缺口。

本研究主要采用了以下关键技术方法：基于家蚕丝腺组织样本的eccDNA测序鉴定；线性DNA片段转染多种细胞系（昆虫Sf9、家蚕BmN、草鱼CIK和人卵巢癌COV362细胞）的环化效率分析；RNA干扰基因沉默技术；DNA pull-down联合质谱分析蛋白质相互作用；体外细胞游离反应系统验证蛋白质功能；免疫共定位和Southern blot验证环状DNA形成；以及蛋白质纯化和功能域分析。

eccDNA^fib-L的形成效率与断裂点侧翼序列长度和短直接重复密切相关

研究人员设计了一系列包含eccDNA^fib-L序列但侧翼长度不同的线性DNA片段，并将其转染到不同细胞系中。结果表明，eccDNA^fib-L的形成效率与侧翼序列长度呈正相关，且断裂点两侧的短直接重复序列"GAGT"对其形成至关重要。当删除或突变这些重复序列时，环化效率显著降低。

UV照射和依托泊苷处理细胞促进eccDNA^fib-L形成

通过用UV照射或依托泊苷处理BmN细胞，研究人员发现eccDNA^fib-L的丰度显著增加。同时，凋亡相关基因表达上调和流式细胞术分析证实这些处理确实诱导了细胞凋亡，表明DNA损伤和凋亡途径可能参与了eccDNA的形成。

MMEJ相关基因参与eccDNA^fib-L形成

通过RNA干扰技术沉默MMEJ通路关键基因（XRCC1、Fen1、Polθ和Lig3），研究人员发现eccDNA^fib-L的形成显著减少。这一结果在家蚕和BmN细胞中均得到验证，表明MMEJ通路在eccDNA形成中发挥重要作用。

eccDNA^fib-L形成与DNA修复通路相关

DNA pull-down实验鉴定出多种与eccDNA^fib-L形成相关的DNA修复蛋白，包括Ku、APE、Cdc5L和Polθ等。基因沉默实验进一步证实这些蛋白对eccDNA形成具有调控作用，而PARG则表现出相反的调控效果。

Polθ需要在细胞游离系统中暴露两端直接重复才能连接DNA分子

体外实验表明，Polθ仅当线性DNA片段两端都带有短直接重复序列时才能介导其环化。免疫共定位实验显示Polθ与带有两端重复序列的DNA片段共定位信号最强，进一步支持了这一结论。

Polθ可能通过短直接重复介导eccDNA^fib-L的环化

研究人员将"GAGT"替换为其他短重复序列（"GTAG"、"AGAG"、"CATC"和"CGAT"），发现Polθ仍能介导环化，但效率较低。而当删除一端或两端的重复序列时，环化反应无法进行，表明短直接重复序列对Polθ介导的环化至关重要。

DNA连接酶参与eccDNA^fib-L的形成

实验发现，Polθ介导环化产生的eccDNA^fib-L中间体存在缺口，需要DNA连接酶进行密封。这一发现揭示了eccDNA形成的完整分子途径。

Polθ的DExH-box解旋酶结构域介导eccDNA^fib-L的环化

通过表达和纯化Polθ的不同结构域，研究人员发现仅DExH-box解旋酶结构域就足以介导eccDNA^fib-L的环化。该结构域可能通过解旋DNA、搜索微同源序列并促进末端退火来启动环化过程。

本研究系统阐明了eccDNA^fib-L形成的分子机制。研究发现，eccDNA^fib-L的形成依赖于断裂点两侧的短直接重复序列和足够长度的侧翼序列，且这一过程在不同物种中具有保守性。DNA损伤和凋亡能够促进eccDNA形成，而MMEJ通路特别是Polθ在其中发挥核心作用。Polθ通过其DExH-box解旋酶结构域识别和解旋DNA，搜索微同源序列并介导末端连接，最终在DNA连接酶的参与下完成环化。

这一研究成果不仅首次揭示了Polθ在eccDNA形成中的关键作用，还提出了一个完整的eccDNA生物发生模型：双链DNA断裂后，Polθ通过其DExH-box解旋酶活性解旋DNA，搜索微同源区域进行退火，去除3'突出单链，由DNA聚合酶合成互补链，去除5'突出单链，形成带有缺口的环状DNA分子，最后由连接酶密封缺口完成eccDNA的形成。

该研究的重要意义在于：首先，它明确了MMEJ通路特别是Polθ在eccDNA形成中的核心作用，为理解eccDNA的生物发生提供了新视角；其次，研究发现的短直接重复序列依赖性环化机制可能普遍存在于其他eccDNA的形成过程中；最后，这一发现为针对eccDNA的相关疾病（如癌症）治疗提供了新的潜在靶点。由于eccDNA在肿瘤发生、进化中扮演重要角色，针对其形成机制的干预可能成为未来的治疗策略。