TRIM21通过K63泛素化修饰ALKBH5调控LIAS表达抑制食管鳞癌铜死亡的新机制

《Communications Biology》：TRIM21 promotes K63-linked ubiquitination of ALKBH5 and suppresses cuproptosis via down-regulation of LIAS in esophageal squamous cell carcinoma

本研究揭示了食管鳞癌(ESCC)中TRIM21通过O-GlcNAc转移酶OGT介导的K63泛素化修饰，促进ALKBH5入核并增强其m6A去甲基化酶活性，进而下调LIAS表达并抑制铜死亡(cuproptosis)的分子机制。该发现不仅阐明了TRIM21/ALKBH5/LIAS轴在ESCC中的关键作用，还通过联合应用OGT抑制剂OSMI-1与铜离子载体elesclomol，显著增强了肿瘤细胞对顺铂的敏感性，为克服ESCC化疗耐药提供了新的治疗策略。

　　

论文解读

研究背景：食管鳞癌的困境与铜死亡的新希望

食管鳞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma, ESCC)是一种恶性程度极高的消化道肿瘤，其全球发病率和死亡率居高不下，尤其是在中国，其发病率和死亡率均占全球的一半以上。尽管近年来诊疗技术有所进步，但ESCC患者的总体预后仍然极差，5年生存率仅为15-25%。肿瘤的进展、转移以及化疗耐药是导致ESCC治疗失败的主要原因。因此，深入探索ESCC发生发展的分子机制，并寻找新的治疗靶点，是当前临床面临的迫切需求。

近年来，一种新型的程序性细胞死亡方式——铜死亡(cuproptosis)引起了研究人员的广泛关注。与凋亡、铁死亡等不同，铜死亡是由细胞内铜离子(Cu²⁺)的异常积累所驱动，其核心机制是铜离子与三羧酸循环(TCA cycle)中的脂酰化蛋白结合，导致蛋白聚集和毒性应激，最终引发细胞死亡。这一过程主要由脂酰酸合成酶(Lipoic Acid Synthase, LIAS)和铁氧还蛋白1(Ferredoxin 1, FDX1)等关键分子调控。然而，铜死亡在ESCC中的具体作用及其调控机制尚不明确。

与此同时，E3泛素连接酶TRIM21在多种肿瘤中被报道高表达，并参与调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。TRIM21不仅能够介导经典的K48泛素化降解通路，还能通过K63泛素化修饰调控蛋白的活性、定位和相互作用。此外，RNA去甲基化酶ALKBH5作为m⁶A修饰的关键“擦除器”，其活性受到多种翻译后修饰的调控，但其在铜死亡中的作用鲜有报道。

基于此，来自同济大学附属上海东方医院的研究团队在《Communications Biology》上发表了一项研究，旨在揭示TRIM21在ESCC中调控铜死亡的具体分子机制，并探索其作为克服化疗耐药新靶点的潜力。

关键技术方法

本研究综合利用了生物信息学分析、临床样本验证、体外细胞实验和体内动物模型等多种技术手段。研究人员首先通过TCGA数据库分析了TRIM家族在食管癌中的表达谱，并结合临床样本的免疫组化、qRT-PCR和Western Blot验证了TRIM21在ESCC中的表达水平及其与预后的相关性。在机制探索方面，研究团队运用了免疫共沉淀(Co-IP)、GST Pull-down、质谱分析等技术，证实了TRIM21与ALKBH5之间的直接相互作用，并确定了K147为TRIM21介导的K63泛素化修饰位点。通过RNA免疫沉淀(RIP)、m⁶A-IP、核质分离和免疫荧光等技术，阐明了ALKBH5入核后通过m⁶A去甲基化调控LIAS mRNA稳定性的具体过程。在功能验证方面，研究通过CCK-8、流式细胞术、3D细胞培养和裸鼠皮下移植瘤模型，评估了TRIM21/ALKBH5/LIAS轴对铜死亡及化疗敏感性的影响。此外，研究还利用OGT抑制剂OSMI-1，探讨了O-GlcNAc糖基化修饰在调控TRIM21-ALKBH5相互作用中的关键作用。

研究结果

TRIM21在ESCC中高表达且与不良预后相关

研究人员首先通过分析TCGA-ESCA数据库发现，TRIM21是TRIM家族中在食管癌与正常组织间表达差异最显著的基因之一。进一步的泛癌分析显示，TRIM21在胆管癌、食管癌、胶质母细胞瘤和头颈部鳞癌等多种肿瘤中均存在过表达。在ESCC临床样本中，qRT-PCR、Western Blot和免疫组化结果均证实，TRIM21在肿瘤组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织，且其高表达与肿瘤分期、分级呈正相关，与患者的不良预后呈负相关。这些结果表明，TRIM21在ESCC中扮演着促癌基因的角色。

TRIM21通过K63泛素化修饰促进ALKBH5入核

为了探究TRIM21的促癌机制，研究人员通过免疫共沉淀联合质谱分析，发现TRIM21与RNA去甲基化酶ALKBH5存在相互作用，并通过GST Pull-down实验证实了二者在体外也能直接结合。然而，敲低或过表达TRIM21并不影响ALKBH5的蛋白表达水平，提示TRIM21可能通过非降解性的泛素化修饰调控ALKBH5的功能。进一步的实验证实，TRIM21主要介导了ALKBH5的K63泛素化修饰，而非K48泛素化降解。通过分子对接和点突变实验，研究人员将ALKBH5的泛素化位点锁定在K147位点。功能上，K63泛素化修饰促进了ALKBH5从细胞质向细胞核的转运，而K147位点的突变则显著抑制了ALKBH5的入核。

ALKBH5通过m⁶A去甲基化下调LIAS表达

接下来，研究人员探究了入核后的ALKBH5如何调控下游基因。RNA测序结果显示，过表达ALKBH5后，LIAS和IGF2BP3等基因的表达显著下调。RIP实验证实，ALKBH5能够直接结合LIAS mRNA。机制上，ALKBH5通过其去甲基化酶活性，降低了LIAS mRNA上的m⁶A修饰水平，从而削弱了m⁶A阅读器蛋白IGF2BP3对LIAS mRNA的识别和结合，最终导致LIAS mRNA稳定性下降，蛋白表达减少。

TRIM21/ALKBH5轴通过下调LIAS抑制铜死亡

功能实验表明，敲低TRIM21或ALKBH5均能显著上调LIAS的表达，并增强ESCC细胞对铜离子载体elesclomol诱导的铜死亡的敏感性。这种促铜死亡效应可以被同时敲低LIAS所逆转。此外，过表达ALKBH5的K147R突变体（无法被泛素化修饰）也能增强细胞对铜死亡的敏感性。在裸鼠移植瘤模型中，敲低TRIM21同样能够上调LIAS表达，并显著增强elesclomol的抗肿瘤效果。

OGT介导的糖基化修饰调控TRIM21-ALKBH5相互作用

为了进一步探究调控TRIM21-ALKBH5轴的上游机制，研究人员发现O-GlcNAc转移酶OGT能够与ALKBH5相互作用，并促进其O-糖基化修饰。OGT介导的糖基化修饰增强了ALKBH5与TRIM21的结合，从而促进了TRIM21对ALKBH5的K63泛素化修饰。使用OGT的特异性抑制剂OSMI-1处理细胞，能够有效抑制ALKBH5的糖基化、泛素化以及核转位，从而上调LIAS的表达。

联合靶向OGT与铜死亡通路增强化疗敏感性

最后，研究人员探索了靶向该通路的治疗策略。体外实验发现，联合应用OGT抑制剂OSMI-1与铜离子载体elesclomol，能够协同诱导ESCC细胞发生铜死亡，并显著增强细胞对顺铂的敏感性。在体内实验中，OSMI-1与elesclomol的联合治疗也表现出显著的抗肿瘤效果，且联合顺铂后，能够几乎完全抑制肿瘤的生长。

结论与展望

本研究系统性地揭示了一条由TRIM21驱动的、调控ESCC铜死亡和化疗耐药的新通路。具体而言，TRIM21在ESCC中高表达，并通过OGT介导的O-糖基化修饰，促进了对ALKBH5的K63泛素化修饰。这种修饰增强了ALKBH5的核转位，使其能够对LIAS mRNA进行m⁶A去甲基化，从而降低了LIAS mRNA的稳定性，最终抑制了铜死亡的发生，并导致肿瘤细胞对顺铂等化疗药物产生耐药。

该研究的创新性在于，首次将E3泛素连接酶TRIM21、RNA去甲基化酶ALKBH5和新型细胞死亡方式铜死亡联系起来，构建了一个从蛋白翻译后修饰到RNA表观遗传调控的复杂调控网络。更重要的是，研究不仅阐明了分子机制，还提出了具有转化潜力的治疗策略。通过联合应用OGT抑制剂OSMI-1和铜死亡诱导剂elesclomol，能够有效逆转TRIM21/ALKBH5轴介导的铜死亡抑制，并显著增强ESCC对顺铂的敏感性。这为克服ESCC的化疗耐药提供了新的理论依据和潜在的联合用药方案，具有重要的临床转化价值。