前噬菌体边界精准注释揭示丝状噬菌体与双果冻卷噬菌体间溶原相关元件的水平转移

《Communications Biology》：Prophage border curation reveals horizontal transfer of lysogeny-related elements between filamentous and double jelly-roll phages

本研究针对非尾噬菌体（特别是丝状丝状噬菌体和双果冻卷噬菌体）整合位点注释不精确的难题，通过对688个弧菌基因组进行前噬菌体-宿主连接点精准注释，系统揭示了不同噬菌体亚型通过水平基因转移共用宿主整合机制（XerC/D）的进化策略，发现噬菌体编码的超变区（pHVRs）是抗噬菌体系统和毒力因子等武器化遗传创新的热点，并建立了结合标记预测与dif样模体检测的新方法显著提升预测准确性，为理解非尾噬菌体的进化生态学提供了重要见解。

　　

在病毒学研究中，尾噬菌体（Caudovircetes）长期占据着噬菌体-细菌相互作用模型的核心地位。然而，那些通常被忽视的非尾噬菌体，特别是丝状丝状噬菌体（inoviruses）和具有双果冻卷（Double Jelly-Roll, DJR）衣壳的噬菌体，其实在环境中无处不在，并能深刻改变细菌的表型特征。这些非尾噬菌体独特的生物学特性，如对氯仿的敏感性和密度梯度离心中浮力密度异常，导致它们在标准实验室纯化过程中活性大量损失，这些技术挑战长期阻碍了人们对它们生态重要性的理解。

随着基因组学分析的发展，研究人员发现丝状噬菌体和DJR噬菌体主要以前噬菌体（prophages）的形式整合在微生物基因组中持久存在。弧菌属（Vibrio）作为研究丝状噬菌体和DJR噬菌体共存的理想模型系统，其中对丝状噬菌体CTX的研究极大地拓展了对前噬菌体介导致病机制的认识。CTX编码霍乱毒素亚基CtxA/B（称为CTX+），并通过溶原转换赋予霍乱弧菌（Vibrio cholerae）毒力。虽然CTX+前噬菌体仅限于霍乱弧菌及其近亲微小弧菌（Vibrio mimicus），但缺乏CtxA/B的CTX-变体分布更广，存在于超过50%的弧菌物种中。尽管关于CTX-前噬菌体对宿主表型影响的研究有限，但近期证据表明它们在细菌生态适应中具有积极作用。

相比之下，DJR噬菌体直到最近才从弧菌中分离出来，但其流行程度、生活策略和对宿主影响的证据正在迅速积累。对Autolykiviridae家族DJR噬菌体的研究揭示了它们感染多种弧菌的能力，同时DJR元件可以作为染色体外DNA或前噬菌体在弧菌中持续存在，并具有自发诱导活性。这些观察结果将DJR噬菌体定性为其细菌宿主的捕食者（裂解生长）或寄生虫（溶原生长）。最近一项研究在931株弧菌科（Vibrionaceae）细菌中检测到39.6%含有DJR元件，表明其分布比之前认为的更广泛。此外，研究发现用DJR噬菌体No16溶原化杀鲑弧菌（Vibrio anguillarum）能增加细菌的毒力和生物膜形成能力。

尽管取得了这些进展，当前对非尾（前）噬菌体的调查大多忽略了溶原相关元件的关键特征，特别是噬菌体附着位点（attP，用于封装噬菌体基因组）以及左右前噬菌体-宿主连接点（attL/R，用于整合的前噬菌体基因组）。即使少数原型丝状噬菌体参与了溶原范式，这一知识空白依然存在。自动化生物信息学工具的应用常常因前噬菌体边界模糊而导致噬菌体基因组结构和溶原机制的误判。

为了克服这一挑战，研究人员从688个高质量弧菌物种基因组中鉴定出515个丝状噬菌体和258个DJR噬菌体，并手动验证了每个前噬菌体的attL/R连接点。由此产生的经过精心整理的非尾前噬菌体基因组数据集为了解这些噬菌体提供了宝贵的见解，并特别促成了：（i）对非尾噬菌体基因组变异的系统分类及其溶原相关元件的表征；（ii）鉴定出两个噬菌体类群中特定成员共享的一个保守溶原模块；（iii）应用了一种结合标记预测和dif样模体检测的策略，显著提高了预测细菌基因组中非尾前噬菌体元件的准确性。

为了开展研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术方法：从NCBI RefSeq数据库获取688个完整或染色体级别的弧菌物种基因组；使用基于隐马尔可夫模型（HMM）的搜索策略鉴定前噬菌体区域，并通过手动比对精确界定前噬菌体基因组边界（attL/R）；选择Zot（丝状噬菌体）和主要衣壳蛋白P2（DJR噬菌体）作为系统发育标记，使用IQ-TREE进行最大似然系统发育树重建；通过比较基因组学识别噬菌体编码的超变区（pHVRs）并进行功能注释；建立结合标记基因对和dif样模体检测的前噬菌体精准预测新流程；使用Intersection-over-Union（IoU）指标评估预测工具性能。

识别弧菌中的非尾前噬菌体

弧菌基因组通常含有多个同源的非尾前噬菌体。然而，基于Illumina的短读长测序解析长重复区域的能力有限，这阻碍了从碎片化的细菌基因组中重建完整的前噬菌体序列。为了全面评估这些非尾前噬菌体的进化和生态特征，研究人员从NCBI RefSeq数据库中检索并分析了688个完整或染色体级别的弧菌物种基因组。

使用基于HMM的搜索策略，研究人员通过检测与保守噬菌体标记具有显著同源性的成簇基因排列来鉴定前噬菌体区域。然后对每个候选区域进行手动整理，以精确描绘前噬菌体基因组边界——特别是两个前噬菌体-宿主连接点attL和attR——以确保提取完整的前噬菌体基因组。该方法最终得到一个包含515个丝状噬菌体和258个DJR前噬菌体的数据集。分析显示，约60%（415/688）的被分析基因组含有至少一个丝状噬菌体或DJR前噬菌体。

两种噬菌体类群的整合策略

丝状噬菌体通过两种重组途径之一建立溶原性：整合酶（Integrase, Int）介导的位点特异性重组或利用宿主XerC/D重组酶。在弧菌物种中，已鉴定的丝状噬菌体一致使用XerC/D途径，在其前噬菌体的attL/R连接点和封装噬菌体基因组的attP位点具有dif样序列。这些靶向dif的元件缺乏内源性整合酶，而是利用宿主XerC/D重组酶整合到宿主dif位点。因此，它们被称为“利用Xer的整合性移动元件（Integrative Mobile Elements exploiting Xer, IMEXs）”。弧菌的两个染色体各含有一个dif位点，在细胞分裂期间XerC/D在此处解析染色体二聚体。这种保守性使得dif位点成为IMEXs传播的理想靶点。

同样，DJR前噬菌体采用两种平行的整合策略：（i）通过编码完整的重组机器（包括Int、阻遏蛋白，有时还有切除酶Xis）进行位点特异性整合；或（ii）利用宿主XerC/D。这两种变体分别被命名为“int型”和“dif型”，在弧菌物种中共存。两种亚型在核心基因组上显示出整体相似性，但在溶原模块上存在差异，表明这种变异源于水平基因转移（Horizontal Gene Transfer, HGT）事件。前噬菌体边界整理揭示，dif型成员模拟全长（28-bp）、左臂（17-bp）或右臂（17-bp）的dif样attP，以靶向染色体dif-1或dif-2位点，这也使它们符合IMEXs的定义。相比之下，int型成员在其靶位点偏好上表现出更大的变异。除了先前描述的编码tRNA二氢尿苷合成酶的dusA基因座外，研究人员在弧菌染色体I上鉴定出五个先前未被识别的整合位点。

噬菌体进化为IMEXs，利用宿主重组机制而非编码自身的机制，是旨在优化基因组资源的进化权衡的一个典型例子。这种被研究人员称为“进化经济性”的策略对于以编码多功能蛋白的极简基因组为特征的丝状噬菌体特别有利。比较基因组学显示，弧菌丝状噬菌体拥有高度紧凑的基因组（8.6±2.0 kb, n=495）。相比之下，在其他类群中鉴定的几个编码Int的丝状噬菌体具有更大的基因组。类似地，与int型变体相比，dif型DJR噬菌体利用宿主重组机制也有助于其进化经济性（12.9±1.0 kb, n=140 vs. 13.9±0.9 kb, n=97）。

溶原元件表征揭示的噬菌体生活策略

弧菌dif型DJR变体与假交替单胞菌噬菌体PM2（第一个被鉴定的含脂质噬菌体）具有广泛的基因组共线性。自20世纪70年代以来，PM2作为膜形态发生的模型被深入研究，显著增进了我们对脂质在噬菌体衣壳组装和基因组递送中功能的理解。尽管历史上被归类为严格裂解性噬菌体，但这一定性缺乏实验支持，仅基于描述性报告。重新分析表明，这一定性值得重新评估。

从机制上讲，噬菌体整合涉及噬菌体attP和细菌attB之间的相互重组。该过程产生杂交的attL/R连接点，界定前噬菌体边界，并将attP侧翼的基因重新定位为前噬菌体末端。因此，PM2的推定attP位点应位于p15和p16基因之间，这两个基因是靶向dif的DJR前噬菌体的典型末端。确实，研究人员在这个精确位点鉴定了一个17-bp的左臂dif样attP。这种基因组构型在溶原期间是有功能的，因为前噬菌体切除已在假交替单胞菌噬菌体Cr39582中得到实验验证，该噬菌体在p15和p16之间含有一个相同的17-bp attP模体。值得注意的是，p16（编码转录阻遏蛋白）和p15（编码转录调节蛋白）构成了PM2样基因组中唯一向左转录的操纵子。与dif样attP一起，这些元件似乎构成了一个保守的溶原模块。相比之下，能够在多种弧菌物种中形成噬菌斑的自溶病毒（autolykiviruses）缺乏可检测的溶原元件，仅保留与dif型和int型DJR亚型同源的结构和裂解基因。这证实了它们在DJR噬菌体中作为专性裂解专家的分类。总的来说，这些发现突出了系统表征噬菌体溶原模块以充分阐明噬菌体生活策略的必要性。

pHVRs作为前噬菌体-细菌共生中的进化催化剂

噬菌体编码的超变区（phage-encoded Hypervariable Regions, pHVRs）在丝状噬菌体基因组中的出现最早于1998年被描述，但其具体作用仍然不清楚。随着抗噬菌体防御机制表征的进展，近期对弧菌非尾前噬菌体的基因组分析表明，这些pHVRs是噬菌体防御机制所需的附属基因。独立证据证实了这一假设，并且研究更具体地阐明了哪些噬菌体谱系编码pHVRs，以及它们的精确基因组位置、功能和潜在起源。

通过比较基因组学，研究人员发现丝状噬菌体中pHVRs的出现与xafT基因（编码Xer重组激活因子）共存，从而将CTX-噬菌体分为两个亚型：CTX-I和CTX-II。两个亚型都以阻遏蛋白基因rstR开始其整合基因组，但表现出不同的下游基因组结构：CTX-I变体含有平均长度为1.9±1.3 kb的pHVRs，位于zot和xafT之间。CTX-II变体缺乏pHVRs，zot下游紧接ace和/orfU，有或没有少数下游假基因。值得注意的是，编码xafT同源物（p15）的dif型DJR前噬菌体也含有pHVRs（平均长度1.9±1.2 kb），侧翼为p15和编码内溶素或孔蛋白（holin）的特定裂解基因（p5, gp-k等）。int型变体的pHVRs位于int基因和特定裂解基因之间，平均长度为1.7±0.9 kb。总的来说，这些pHVRs并非随机放置，而是一致地存在于噬菌体裂解和溶原模块之间。尽管基因组大小不同，但在CTX-I丝状噬菌体、dif型和int型噬菌体之间未观察到pHVR长度的显著变异。这表明不编码完整重组系统所节省的基因组空间并未被重新分配用于扩展这些可变区域。这支持了研究人员关于利用宿主重组系统可能有利于整体基因组压缩的假设。

HGT是塑造pHVR组成的关键驱动力。发现这些区域内的基因簇与细菌重叠群和其他温和噬菌体基因组具有同源物，表明pHVRs是遗传交换的热点。除了多样的抗噬菌体作用外，pHVRs还可能有助于毒力因子的传播。例如，几个微小弧菌丝状噬菌体在其pHVRs内编码耐热直接溶血素（Thermostable Direct Hemolysin, TDH），这是一种副溶血性弧菌特有的外毒素。然而，pHVR的整合可能给精简的噬菌体基因组带来基因组负担。

由于pHVRs的存在，CTX-I前噬菌体显著大于CTX-II前噬菌体，但前者在数量上比后者具有4倍的优势。它们的跨物种相对丰度进一步证实了对CTX-I亚型的偏好，表明从获得pHVRs中获得的选择优势超过了基因组负担。值得注意的是，研究人员鉴定了几种退化的CTX-I元件，它们缺乏典型的噬菌体特征但保留了pHVR特征，表明即使前噬菌体失去功能完整性，也可能保留宿主适应性遗传物质。总之，pHVRs作为适应性枢纽，介导非尾噬菌体、细菌宿主和其他温和噬菌体