《Journal of Virological Methods》：Targeting Yellow-Fever Virus: Development of a specific aptamer to NS1 protein
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黄病毒NS1蛋白的DNA aptamer开发及诊断应用研究。通过毛细管电泳-系统进化 ligands实验（CE-SELEX）三轮筛选获得特异性aptamer Flav5，其与YFV-NS1的解离常数（Kd）为34.5±8.2nM，对登革热和寨卡病毒NS1蛋白无交叉反应。分子对接显示Flav5稳定结合于NS1四聚体间隙，置信度＞0.95。该aptamer具有高特异性、热稳定性和易合成特性，适用于多血清型共存的地区黄病毒快速诊断。
Mariane Izabella Abreu de Melo | Alessandra Nunes Duarte Miranda | Antero Silva Ribeiro de Andrade
巴西米纳斯吉拉斯州贝洛奥里藏特市，核技术发展中心（CDTN），辐射、矿物与材料科学与技术研究生项目
摘要
黄热病病毒（YFV）是一种由蚊子传播的黄病毒，尽管已有有效的疫苗，但它仍然是一个重大的公共卫生问题。由于登革热病毒和寨卡病毒等黄病毒之间的高度抗原相似性，准确的鉴别诊断仍然具有挑战性，这影响了现有血清学检测方法的特异性。适配体因其高特异性、热稳定性和易于合成而成为抗体在诊断应用中的有希望的替代品。在这项研究中，我们利用基于毛细管电泳的SELEX（CE-SELEX）技术，开发了一种针对黄热病病毒非结构蛋白1（NS1）的DNA适配体（Flav5）。经过三轮选择后，对适配体库进行了测序和分析。特异性检测显示Flav5与登革热病毒（1-4型）和寨卡病毒的NS1蛋白仅有极小的交叉反应。通过定量PCR测定，Flav5对YFV-NS1的结合亲和力很高，解离常数（Kd）为34.5 ± 8.2 nM。利用HDOCK服务器对Flav5的三维结构进行了建模，并将其与四聚体YFV-NS1对接，结果显示在NS1的亚基间隙内存在一个稳定的结合界面，置信度得分超过0.95。Flav5适配体在开发针对黄热病的特异性诊断平台方面具有巨大潜力，尤其是在多种临床相关黄病毒共存的地区。其高亲和力、高特异性以及良好的分子对接特性使其成为适用于即时诊断工具的理想候选者。
引言
黄热病病毒（YFV）是一种由蚊子传播的黄病毒，在热带和亚热带地区，尤其是非洲和南美洲，仍然构成严重的公共卫生威胁（Malik等人，2023年）。尽管已有有效的疫苗，但由于疫苗接种覆盖率低、城市化、气候变化和人们对疫苗的犹豫等因素，疫情仍然时有发生。
黄热病病毒属于黄病毒科（Flaviviridae），该科还包括其他重要的病原体，如登革热病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）和西尼罗河病毒（WNV）。这些病毒具有抗原相似性，导致血清学检测中出现交叉反应，从而影响准确鉴别诊断。目前的金标准诊断方法（如ELISA、RT-PCR和病毒分离）需要专门的基础设施和受过培训的人员，这限制了它们在资源有限地区的应用（Madere等人，2025年）。在多种黄病毒共存的地区，这一诊断挑战尤为突出，同时这些地区获取先进诊断工具的难度也较大。
为应对这些挑战，人们越来越关注开发具有高特异性、稳定性且适合即时使用的分子工具。适配体是通过“指数富集法系统进化”（SELEX）过程（Ellington和Szostak，1990年；Tuerk和Gold，1990年）筛选得到的单链DNA或RNA寡核苷酸，它们在诊断应用中成为抗体的有希望的替代品或补充。适配体对其目标具有高亲和力和特异性，可合成生产，热稳定性好，并且可以通过修饰来增强其功能（Kong和Byun，2013年）。这些特性使得适配体特别适合用于开发低成本、便携式的诊断平台，适用于流行病地区。
鉴于黄热病病毒及其他黄病毒持续造成的负担，特别是在服务不足的地区，迫切需要推进创新的诊断解决方案。近年来，针对多种病毒靶标（包括黄病毒抗原）成功开发出了适配体，证明了它们在生物传感器、侧向流动检测和其他诊断格式中的实用性（Argondizzo等人，2020年；Blázquez和Jiménez de Oya，2024年）。
非结构糖蛋白1（NS1）是黄病毒的关键抗原，它以膜相关形式和可溶性分泌形式存在。NS1在病毒复制中起重要作用，并显著影响宿主免疫反应的调节（Fisher等人，2023年）。鉴于其诊断重要性，选择NS1作为开发针对黄热病病毒的特异性DNA适配体的目标。
本研究探讨了利用适配体策略来提高黄热病及其他相关黄病毒诊断工具的特异性和有效性，旨在解决全球卫生诊断中的关键需求。
部分内容摘录
非结构蛋白1（NS1）
用于筛选DNA适配体的重组黄热病病毒NS1蛋白是在哺乳动物HEK293细胞中表达的（来源：Native Antigen Company，英国）。储备溶液的浓度为0.63 mg/ml，通过SDS-PAGE纯化（纯度大于90%），储存在pH 7.4的PBS缓冲液中，置于-20oC。负选择和特异性检测中使用的登革热病毒和寨卡病毒蛋白也来自Native Antigen Company。购买的蛋白包括：DENV1-NS1（0.5 mg/ml）、DENV2-NS1
CE-SELEX筛选
毛细管电泳被有效地用于进行三轮SELEX筛选，目标蛋白为YFV-NS1。寡核苷酸文库在方法部分描述的条件下与YFV-NS1孵育。分离过程中，与YFV-NS1结合的寡核苷酸的保留时间一致，介于2.96至3.02分钟之间。通过优化电泳条件，实现了未结合寡核苷酸与适配体-蛋白复合物之间的清晰分离
讨论
本研究描述了一种名为Flav5的DNA适配体的成功开发和表征，该适配体对黄热病病毒的非结构蛋白1（NS1）具有高亲和力和特异性。该适配体是通过CE-SELEX技术筛选得到的，该技术基于电泳迁移率精确分离高亲和力配体，并通过结构、生化和计算分析进行了进一步验证。
在三轮筛选后测序的适配体候选物中...
结论
Flav5适配体在针对黄热病病毒的诊断平台中具有巨大潜力，尤其是在多种临床相关黄病毒共存的地区。其高亲和力和特异性以及良好的结构对接结果使其成为即时诊断工具的理想候选者。后续研究应重点将其整合到诊断平台中，包括侧向流动检测、电化学生物传感器等。
CRediT作者贡献声明
Andrade Antero Silva Ribeiro：撰写原始草稿、监督、项目管理、方法学设计、资金获取、数据分析、概念构思。
Mariane Izabella Abreu de Melo：撰写原始草稿、实验研究、数据分析、数据管理。
Alessandra Nunes Duarte Miranda：方法学设计、实验研究、数据分析、数据管理。伦理批准
本文不包含任何作者进行的涉及人类参与者或动物的研究。
资助
本研究得到了米纳斯吉拉斯州研究基金会（FAPEMIG，APQ-00557–21）、国家科学技术发展委员会（CNPq）、高等教育人员培训协调委员会（CAPES）、研究项目资助机构（Finep）和国家核能委员会（CNEN）的支持。
利益冲突声明
所有作者均已阅读并批准了手稿的最终版本。本工作尚未在其他期刊上发表，目前也没有被任何期刊接受审稿。作者声明没有已知的财务或个人利益冲突可能影响本文的研究结果。
