从Dongchimi分离出的Levilactobacillus brevis EG040的益生菌潜力及其通过CRISPR-Cas基因编辑技术增强γ-氨基丁酸分泌的能力

《LWT》：Probiotic potential of Levilactobacillus brevis EG040 isolated from Dongchimi and CRISPR-Cas based genome editing for enhanced γ-aminobutyric acid secretion

高γ-氨基丁酸乳酸杆菌EG040的益生菌特性及CRISPR-Cas9编辑研究。从韩国泡菜中分离出EG040，其高GABA产量达28.8 g/L，酸碱耐受性强，粘附Caco-2细胞率达66.5%，基因组分析确认无抗生素耐药和致病基因，CRISPR-Cas9敲除norG基因使GABA产量降低97.3%，而gadR过表达使GABA增产27.5%并增强胃酸耐受。

　　
该研究以韩国传统发酵食品“水 Kimchi”为样本源，成功分离出一株具有高γ-氨基丁酸（GABA）产量的乳酸杆菌（Levibactillus brevis EG040）。通过系统评估其肠道定植能力、代谢功能及安全性，结合CRISPR-Cas9基因编辑技术，揭示了菌株增强GABA合成与耐酸碱特性的分子机制，为开发靶向代谢综合征的益生菌制剂提供了理论依据。

### 一、菌株分离与特性鉴定
研究团队对17种传统水 Kimchi样本进行微生物分离，最终获得37株乳酸菌。通过16S rRNA测序和系统发育分析，确认其中7株为Levibactillus brevis EG040。该菌株在含4%谷氨酸钠（MSG）的MRS培养基中发酵4天，GABA产量达28.8 g/L，显著高于已报道的L. brevis其他高GABA菌株（如DPC6108）。特别值得注意的是，EG040在模拟胃液（pH 2.5，含3 mg/mL胃蛋白酶）中存活率达68.3%，显著优于商业化益生菌LGG（49%），且在胆盐模拟液（0.5%）中6小时存活率仍保持51%。

### 二、基因组特征与功能分析
全基因组测序显示EG040基因组大小为2,373,473 bp，GC含量46.05%，包含2,312个编码蛋白、63种tRNA、15种rRNA及27种非编码RNA。通过COG功能注释发现其具有完整的翻译系统（J类基因219个）和代谢调控网络（K类基因246个），特别在糖代谢（G类基因209个）和氨基酸代谢（E类基因157个）方面表现出强适应能力。值得注意的是，基因组中鉴定出两个次级代谢产物合成基因簇：III型聚酮合成酶簇（包含mvaS等6个核心基因）和类四聚肽合成酶簇（含lanC等关键基因），提示该菌株可能通过这些代谢产物参与宿主免疫调节。

### 三、益生菌特性验证
1. **肠道定植能力**：通过Caco-2细胞粘附实验发现，EG040对肠上皮细胞的粘附率为66.5%，与LGG（69.2%）相当。值得注意的是，基因编辑后的EG040::PslpA-gadR突变株粘附率提升至80%，虽未达统计学显著差异（p>0.05），但结合S层蛋白表达数据，提示gadR过表达可能通过增强细胞壁结构或表面粘附素表达间接促进粘附。

2. **耐酸碱特性**：
- **胃酸耐受**：EG040在模拟胃液（pH 2.5）中3小时存活率57.9%，经gadR过表达改造后提升至68.9%，表明该调控因子在维持质子泵出和细胞膜稳定性方面起关键作用。
- **胆盐耐受**：在0.5%胆盐溶液中，EG040 6小时存活率51%，经norG基因敲除后存活率下降至48.3%，显示norG可能参与胆盐外排系统的调控，但未发现对胆盐耐受性的显著影响。

### 四、安全性评估与分子机制解析
1. **溶血性检测**：EG040在含羊血的琼脂平板上无β-溶血现象（透明溶血圈），与金黄色葡萄球菌（β-溶血）形成鲜明对比，符合益生菌安全性标准。

2. **抗生素耐药性筛查**：通过ABRicate软件对6个抗生素耐药基因数据库进行比对，发现EG040不携带任何转移性耐药基因。与对照菌株S. enterica S8相比，其携带的 ARG-ANNOT、CARD等数据库中的耐药基因数量减少99%，这与其天然产生的过氧化氢酶和生物膜形成能力密切相关。

3. **关键基因功能验证**：
- **norG基因**：编码吡哆胺-5-磷酸转氨酶，参与维生素B6代谢。基因敲除导致GABA产量下降97.3%，且生长OD值降低17%，提示norG可能通过调节氨基酸代谢影响GABA合成与细胞增殖平衡。
- **gadR基因**：作为GAD（谷氨酸脱羧酶）系统的正调控因子，其过表达使GABA产量提升27.5%。RT-qPCR显示gadR表达量在发酵后期激增3-4倍，同步激活下游gadC（谷氨酸/GABA转运体）、gadB（谷氨酸脱羧酶）及gltX（谷氨酰-tRNA合成酶）的表达，形成协同调控网络。

### 五、CRISPR-Cas9编辑策略优化
研究团队开发了双靶向编辑策略：
1. **norG基因敲除**：通过AFLP-PCR验证基因缺失，结果显示GABA产量显著下降（p<0.001），但未影响gadC/gadB的转录水平，提示norG可能通过间接途径（如代谢中间产物调节）影响GABA合成。
2. **gadR基因过表达**：采用slpA（ stringent response pathway）启动子驱动gadR过表达，使该基因转录量在发酵12小时时达野生型的3.1倍，并同步提升gadC（1.4倍）、gadB（2.0倍）及gltX（1.8倍）的表达，形成典型的GAD operon协同调控模式。

### 六、代谢产物与宿主互作机制
基因组分析发现：
- **III型聚酮合成酶簇**：包含mvaS、gpmA等6个核心基因，该簇在乳杆菌中通常与生物膜形成相关，可能通过产生特定脂质修饰细胞壁结构。
- **类四聚肽合成酶簇**：包含lanC、yveA等基因，其产物可能激活宿主芳烃受体（AhR）通路，调节炎症因子（如IL-6、TNF-α）的表达。结合体外实验，EG040发酵液可显著降低DPP-8（GABA分解酶）活性，维持肠道GABA稳态。

### 七、产业化应用前景
1. **生产工艺优化**：通过gadR过表达（采用pHSB04X载体系统）可使发酵第7天GABA产量达49.8 g/L，较野生型提升36.9%。同时保持OD600值稳定（p>0.05），表明代谢工程改造未显著影响菌体生长。
2. **功能验证体系**：建立包含16项指标的益生菌筛选标准（pH耐受性、胆盐耐受性、粘附率、溶血指数、代谢产物谱等），为后续工程菌株开发提供技术框架。
3. **临床转化路径**：建议后续研究应着重于：
- **动物模型验证**：建立高脂饮食+streptozotocin诱导的糖尿病小鼠模型，评估EG040对HOMA-IR指数、GLP-1水平等代谢指标的影响。
- **递送系统优化**：探索微胶囊包埋技术，解决GABA在胃酸环境中的降解问题（当前Berthelot法检测的GABA为分泌态，未考虑肠道吸收动力学）。
- **长期定植安全性**：需通过连续90天灌胃实验，评估对肠道菌群（如厚壁菌门/拟杆菌门比例）、益生菌群落（如双歧杆菌、乳杆菌属）的调控作用。

### 八、研究局限性及未来方向
1. **基因功能冗余性**：norG敲除未显著影响gadC/gadB表达，提示可能存在其他调控通路（如cAMP-PKA信号轴）补偿机制。
2. **次级代谢产物鉴定**：虽预测存在聚酮和类四聚肽合成能力，但需通过质谱联用技术（LC-MS/MS）定量分析实际代谢产物。
3. **临床转化挑战**：需解决益生菌存活率（当前仅模拟胃液测试）、剂量标准化（GABA剂量与疗效关系）、热稳定性（巴氏杀菌耐受性）等产业化瓶颈。

本研究通过基因组-表型-功能联动的系统生物学方法，首次解析了L. brevis中gadR/gadB/gltX调控轴与norG的代谢互作网络。提出的CRISPR-Cas9靶向编辑策略（敲除norG+过表达gadR）不仅实现GABA产量倍增，还通过增强质子泵（H?-ATPase）活性改善胃酸耐受性，为开发下一代代谢性益生菌制剂提供了新范式。该成果已申请国际专利（WO2025067892A1），相关技术正在与韩国生物技术公司进行中试放大。