《Microchemical Journal》：Comparison of nested PCR coupled DNA barcoding and an all-in-one dd PCR in detection of highly degraded DNA in
Fritillariae Cirrhosae Bulbus
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干姜连花 bulbs (FCB) 原料因储存不当导致DNA降解，传统条形码和嵌套PCR方法扩增失败，本研究开发ddPCR技术实现5拷贝灵敏度检测，有效解决原料鉴定难题。
李园园|胡静文|陈红玲|赵婷婷|牛书琪|刘思静|白静|陈荣|郭金林
中国成都中医药大学药学院西南中药资源国家重点实验室，成都611137
摘要
Fritillariae cirrhosae（FCB）因其润肺化痰的功效而被广泛用于植物补充剂和草药产品中。然而，由于需求量大，导致了掺假现象，这影响了市场的诚信、治疗效果和可持续利用。此外，不适当的储存条件常常会导致FCB植物材料中的DNA降解，使得传统的鉴定方法难以准确区分真品和伪品，从而进一步增加了鉴定的复杂性。在本研究中，我们收集了25份从1972年到2024年的FCB样本。最初尝试了标准的DNA条形码技术和迷你条形码技术，但两种方法都没有获得理想的结果。随后应用了更复杂的嵌套PCR技术，发现该技术能够有效检测高度降解的DNA。为了进一步简化检测过程，开发并优化了滴液数字PCR（ddPCR）技术。所开发的ddPCR系统实现了5个拷贝和10个拷贝的检测限（LOD和LOQ），从而能够一步放大和检测上述高度降解的DNA。与这两种方法相比，ddPCR更为简单方便，本研究有望为类似研究提供有价值的范例和参考，并为高度加工的植物膳食补充剂原料的质量控制提供科学有效的技术解决方案。
引言
消费者对健康和营养的日益重视推动了膳食补充剂消费量的增长，预计到2028年全球市场销售额将超过3000亿美元[10]。膳食补充剂包含多种成分，如维生素、矿物质、植物提取物、氨基酸和脂肪酸，既可以单独使用，也可以组合使用[13,16]。适当的摄入已被证明可以增强免疫功能并降低疾病风险[4]。在美国，根据《膳食补充剂健康与教育法》以及欧盟的相应法规，膳食补充剂被归类为食品[6,14]。然而，对这些产品需求的增加引发了对其质量的担忧[12]。常见的问题包括成分替换、填充物掺假以及用亲缘关系较近的物种替代高价值植物[23]。因此，确保整个生产链中的植物鉴定准确性对于维持质量控制至关重要。
Fritillaria属主要分布于北半球的温带地区[15]。最著名的物种包括F. cirrhosa、F. thunbergii、F. ussuriensis、F. pallidiflora和F. hupehensis等[30]。Fritillariae cirrhosae（FCB）是指F. cirrhosa、F. unibracteata、F. przewalskii、F. delavayi、F. taipaiensis以及F. unibracteata var. wabuensis的干燥鳞茎。FCB以其清热、润肺和止咳的功效而闻名，被广泛用于植物膳食补充剂中[21,22]。一种流行的制剂——川贝止咳糖浆，在缓解咳嗽和痰液方面非常有效，在中国、马来西亚、加拿大和美国以及新加坡都有销售（M. [5]; Wcw等人，2006）。然而，野生FCB植物的稀缺和高成本导致了普遍的掺假现象，这损害了产品的效果并破坏了市场诚信。因此，准确鉴定FCB植物及其掺杂物对于确保质量控制至关重要。
目前用于鉴定FCB的方法包括形态分析、显微镜检查[24]、物理化学测试[32]、色谱和光谱技术[20]、基于化学电阻的分析[25,25]等。分子技术因其高准确性和特异性而越来越被用于植物鉴定[7]。常规PCR、嵌套PCR、实时定量PCR以及新开发的PCR-CRISPR/Cas方法已成功应用于多种植物材料的鉴定[9,11,17,18,33]。对于因储存不当而DNA降解的材料，常规分子技术常常面临挑战[28]。为了克服这些限制，滴液数字PCR（ddPCR）作为一种强大且有前景的分子检测技术应运而生，已被广泛应用于疾病诊断、转基因食品检测和食品安全监测[26]。其基本原理是将样品和扩增混合物分割成多个独立的微小隔间（如滴液或微孔），每个隔间分别进行扩增反应，然后进行信号分析[27]。该技术能够实现对目标核酸分子的绝对定量，并提供比常规PCR方法更高的灵敏度，从而有效检测低丰度的样本[8]。
最初，本研究使用常规DNA条形码技术分析了25份多年收集的FCB样本，但有13份样本未能扩增成功。随后尝试了使用较短扩增子的DNA迷你条形码技术，但仍有7份样本未能扩增成功。最终，通过两轮扩增的嵌套PCR成功扩增了剩余7份样本中的目标DNA。为了降低嵌套PCR的程序复杂性和污染风险，采用了ddPCR进行精确鉴定。研究结果表明，基于ddPCR的特异性鉴定方法具有简化的流程和单轮扩增的特点，能够准确鉴定高度降解的DNA样本，从而提供了一种稳健有效的技术解决方案。
材料
表1提供了所有FCB植物材料的基本信息。Probe dPCR HiTap Mix购自NeoDx Biosciences（北京，中国）；Taq DNA聚合酶购自TransGen Biotech（北京，中国）；dNTPs购自Sangon Biotech（上海，中国）；琼脂糖购自Yeasen Biotech（上海，中国）；DNA标记物购自Sangon Biotech（上海，中国）；凝胶绿色素购自Solarbio（北京，中国）；DNA提取试剂盒也购自...
基于DNA条形码、迷你条形码和嵌套PCR结合DNA条形码的25份样本鉴定结果
本研究中使用的25份样本来自不同的来源和储存时间。最早的样本采集于1972年，目前储存时间已达53年（图1）。所有样本的基因组DNA均使用商业提取试剂盒提取，并通过NanoDrop分光光度计测定浓度（表S1），随后进行琼脂糖凝胶电泳分析。除了2024年采集的大多数样本外...
结论
准确可靠的鉴定对于确保FCB原料的质量、维护市场诚信以及最大化其健康效益至关重要（Z.-W. [19,25]）。然而，过去的经验表明，DNA降解常常导致许多样本的扩增失败。为了解决这个问题，分析了来自不同年份的25份FCB样本，其中最古老的样本可追溯到1972年，储存时间为53年。
CRediT作者贡献声明李园园：撰写——初稿、方法学设计、数据管理。胡静文：方法学设计。陈红玲：撰写——审稿与编辑、方法学设计、资金筹集、数据管理、概念构思。赵婷婷：方法学设计。牛书琪：方法学设计。刘思静：方法学设计。白静：方法学设计。郭金林：撰写——审稿与编辑、资金筹集、概念构思。
资助
本工作得到了国家重点研发计划[2022YFC3500900]和四川省科技厅项目[25QNJJ4591]的财政支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
