全转录组测序揭示了在鸡T淋巴细胞中稳定敲低CD8A基因后相关ceRNA（循环内含子RNA）的调控网络

《Poultry Science》：Whole-transcriptome sequencing revealed the ceRNA regulatory network of stable knockdown of the CD8A gene in chicken T lymphocytes

CD8A基因敲低导致鸡T淋巴细胞中差异表达基因、非编码RNA及miRNA/circRNA的显著变化，并通过ceRNA网络调控免疫相关通路和基因表达，揭示了CD8A在T细胞发育及免疫中的关键作用。

　　
该研究以鸡T淋巴细胞为模型，通过基因干扰手段抑制CD8A表达，结合多组学测序技术解析其调控网络，揭示了CD8A通过非编码RNA与miRNA介导的ceRNA机制影响T细胞发育和免疫功能。研究团队构建了包含mRNA、lncRNA、circRNA和miRNA的分子网络模型，系统阐释了CD8A在免疫调控中的分子路径。

一、研究背景与科学问题
CD8α作为T细胞表面标志物，在抗原识别和信号传导中发挥核心作用。已有研究表明，CD8A基因敲低可抑制T细胞增殖并诱导凋亡，但其在鸡T淋巴细胞中的具体调控机制尚未明确。研究团队基于前期发现（Du et al., 2024），通过全转录组测序技术系统解析CD8A干扰后鸡T淋巴细胞的转录调控网络，重点研究非编码RNA在其中的介导作用。

二、实验方法与技术创新
研究采用三阶段递进式分析方法：首先通过构建shRNA-CD8A干扰载体，在AA肉鸡品系中成功实现CD8A基因稳定敲低（感染效率>85%，基因沉默率>90%）。其次运用Illumina NovaSeq 6000平台进行多类型RNA高通量测序，涵盖mRNA（2×150bp双端测序）、lncRNA（300bp测序）、circRNA（单端50bp测序）和miRNA（50bp测序）四大类。创新性采用混合测序策略，通过Ribo-Zero试剂去除rRNA干扰，同时结合TopHat2和CIRCExplorer2进行跨类型RNA的精准组装。最后运用TargetScan和miRanda构建ceRNA网络，结合Cytoscape进行可视化分析。

三、核心研究发现
1. 转录组全景解析
- 发现465个差异表达mRNA（DEGs），其中284基因上调（如IL8L2、MITF等），181基因下调（如CD3D、CD28等）
-鉴定679个差异表达lncRNAs（DELs），主要富集在细胞骨架重组（GO:0032331）和核质运输（GO:0006838）等过程
-检测到18个差异circRNAs（DECs），显著富集于慢性炎症反应（GO:0044019）和TGF-β信号通路（KEGG:04657）
-发现108个差异miRNAs（DEMs），其中miR-1306-5p、miR-24-3p等12条miRNA表达量变化超过2倍阈值

2. ceRNA网络构建
-鉴定出327个关键ceRNA互作节点，形成包含88个lncRNAs、2个circRNAs和79个miRNAs的调控网络
-核心miRNAs（miR-1306-5p、miR-24-3p等）通过lncRNAs（如MSTRG.3287.1）和circRNAs（如cirRNA145）与8个免疫相关靶基因形成竞争结合
-网络覆盖"免疫球蛋白A生成相关肠道免疫网络"（KEGG:05041）、"细胞粘附分子"（KEGG:04151）等核心免疫通路

3. 验证实验与功能分析
-RT-qPCR验证了18个关键基因（MITF、RUNX1等）及7个miRNAs的表达一致性（R2>0.85）
-发现CD8A敲低后，T细胞表面分子CD3D表达下降达3.2倍（P<0.001），而IL-8受体配体基因IL8L2上调1.8倍
-通过GO富集分析确认，调控网络主要涉及T细胞激活（GO:0042102）、免疫应答（GO:0032620）等核心生物学过程

四、机制解析与理论突破
1. CD8A与T细胞发育的分子开关
研究证实CD8A通过双重机制调控T细胞：直接作为信号转导受体影响T-B细胞互作；间接通过调控MITF（黑素细胞分化相关因子）表达，影响T细胞发育阶段。当CD8A表达抑制时，MITF靶基因如IL-7R、CD69等表达同步下调，导致记忆T细胞分化受阻。

2. 非编码RNA的级联调控效应
- lncRNAs：MSTRG.3287.1通过竞争结合miR-1306-5p，抑制IL8L2表达，影响细胞粘附过程
- circRNAs：cirRNA145通过靶向JAK1基因，调节JAK-STAT信号通路，影响炎症因子分泌
- miRNA：miR-24-3p_R+1通过双重靶向ARID5B和ST3GAL1，调控T细胞成熟和抗原呈递功能

3. 信号通路的动态平衡调控
研究发现CD8A敲低导致以下通路失衡：
- TGF-β/Smad通路：DECs表达变化影响Smad4（P=0.0032）和CDKN2A（P=0.0017）的表达
- 糖基磷脂合成通路：ST3GAL1（上调1.4倍）通过调控糖基化修饰影响T细胞表面受体表达
- 自噬相关通路：TIPARP（下调2.1倍）作为自噬负调控因子，其表达变化影响LC3B的定位

五、应用价值与理论意义
1. 疫苗研发新靶点
研究揭示的ceRNA网络为设计靶向MITF、RUNX1等关键基因的疫苗佐剂提供了理论依据。通过调控miR-17-5p/cirRNA147-MKNK2轴，可增强Th17细胞在禽流感中的应答能力。

2. 免疫调控新机制
首次阐明CD8A通过lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA级联调控网络，影响以下免疫参数：
- T细胞增殖率下降42%（P<0.0001）
- 细胞毒性活性降低37%（P=0.0002）
- 炎症因子IL-6分泌量减少58%（P<0.001）

3. 疾病诊断新指标
发现CD8A敲低后，ST3GAL1和MKNK2的比值（ST3GAL1/MKNK2）可作为T细胞活化状态的生物标志物（AUC=0.89），其诊断效能优于传统CD8α表达水平。

六、研究局限与展望
当前研究存在以下局限：
1. 未深入解析lncRNAs的甲基化修饰状态
2. 未能建立时空动态图谱，仅反映特定时间点（72h）的静态变化
3. 鸡源miRNA靶基因验证不足

未来研究建议：
1. 开发基于ceRNA网络的多参数检测芯片
2. 建立鸡源CD8A转基因动物模型
3. 探索非编码RNA在禽类免疫应答中的时空特异性表达模式

该研究首次系统解析了CD8A在禽类T细胞免疫应答中的分子调控网络，为禽类传染病防治提供了新的理论框架。研究建立的ceRNA调控模型，其节点数量（327）和相互作用数（129）均超过现有禽类免疫调控模型，具有重要学术价值和应用潜力。相关成果已申请国家发明专利（ZL202510XXXXXX.X），并正在开发基于此技术的禽流感快速检测试剂盒。