《Remote Sensing Applications: Society and Environment》：Biochemical oxygen demand estimation using explainable ensemble learning methods
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烟叶水提取物（AECS）在体外成熟过程中对牛卵子具有显著细胞毒性，其尼古丁浓度达158.40 μg/mL并含14.66±4.08 nm纳米颗粒。结果显示AECS处理后卵子染色体异常率升高（P<0.05），ROS水平显著增加，线粒体膜电位降低，表明烟尘多组分协同作用导致卵子氧化应激和能量代谢障碍。
安娜·卡伦·德·卡瓦略·阿尔布克尔克（Ana Karen de Carvalho Albuquerque）、索拉诺·丹塔斯·马丁斯（Solano Dantas Martins）、莱兹·玛丽亚·科斯塔·维拉斯（Leiz Maria Costa Véras）、阿琳·罗德里格斯·德·阿劳茹·诺布雷（Alyne Rodrigues de Araújo Nobre）、瓦尼亚·马里兰德·塞卡托（Vania Marilande Ceccatto）和瓦尔德瓦内·罗查·阿劳茹（Valdevane Rocha Araújo）
塞阿拉州立大学（UECE）生物医学科学高等研究院（ISCB）生理科学研究生项目（PPGCF），地址：Silas Munguba大道1700号，福塔莱萨，CE 60714-903，巴西
摘要
本研究调查了不同浓度香烟烟雾水提取物（AECS）在牛卵母细胞体外成熟（IVM）过程中的细胞毒性，并评估了其中各种化合物（包括尼古丁）之间的潜在协同作用。通过液相色谱法测定尼古丁含量，并利用原子力显微镜（AFM）分析颗粒形态。实验中从当地屠宰场收集了30个牛卵巢样本，仅选择那些细胞质均匀、直径大于110微米且至少被两层紧密的卵丘细胞包围的卵母细胞。将这些卵母细胞分组，在含有5%二氧化碳的湿润环境中，于38.5°C下分别在仅含TCM-199的培养基（CTRL组）或添加了1%、2.5%或5% AECS的培养基中培养24小时。培养结束后，使用Hoechst染色法观察卵母细胞的染色质结构，通过H2DCFDA和JC-1检测活性氧（ROS）和线粒体功能。数据分布采用Shapiro-Wilk检验进行齐性分析，方差分析（ANOVA）采用Tukey事后检验，显著性水平设为P<0.05。结果显示AECS中尼古丁含量较高（158.40 μg/mL），且含有直径为14.66±4.08纳米的纳米颗粒。无论使用何种浓度的AECS，卵母细胞在体外成熟后均表现出较高的染色质降解率，ROS水平升高，线粒体功能下降（P<0.05）。因此可以得出结论，AECS对牛卵母细胞具有显著的细胞毒性，这主要是由于其中尼古丁含量较高所致。
引言
烟草来源于茄科（Solanaceae）的多个尼古丁属（Nicotiana）物种。尽管烟草消费被公认为是导致死亡的主要可预防因素之一，但它仍然在社会上普遍存在[1]。尼古丁是香烟烟雾的主要成分，是一种存在于烟草叶片中的化学碱类物质。这种高度成瘾性的物质能够影响多种生理系统。当通过香烟烟雾吸入时，尼古丁会迅速被肺部吸收并进入血液，随后分布到全身[2]。
需要强调的是，香烟烟雾的气相成分除了尼古丁外还包含超过4700种其他物质，例如丙烯醛、苯并(a)芘和N-亚硝胺等[3]。此外，研究表明香烟燃烧会产生自由基和一氧化氮、亚硝酸盐等分子[4]。这些气相物质会氧化巯基，从而降低谷胱甘肽等保护性分子的浓度[4]。
尼古丁的负面影响包括增加心血管疾病[5]、动脉粥样硬化和细胞衰老[6]的风险，以及促进肺癌的发展[7]。在生殖系统方面，男性长期暴露于含高浓度尼古丁的气溶胶中会导致精子数量减少和血清睾酮水平下降[8]；在女性中，尼古丁会诱导人类胎儿卵巢的体外培养中的卵母细胞凋亡并减少生殖细胞数量[9]。类似地，合成尼古丁也会降低牛卵母细胞的体外成熟率[10]。此外，人类卵泡液中还含有尼古丁的代谢产物可替宁[11]。
鉴于目前仍有许多未解之谜，且以往的研究仅使用了合成尼古丁，本研究首次探讨了香烟烟雾水提取物（AECS）对牛卵母细胞体外成熟的影响。选择使用AECS而非纯尼古丁的原因是吸烟不仅包含尼古丁这种有毒物质，还包含香烟中的其他成分。因此，本研究将综合考虑这些成分的协同作用、相互作用及其整体毒性。研究目标包括：（1）通过测定尼古丁含量和颗粒形态来表征AECS；（2）评估体外成熟卵母细胞的核染色质结构、活性氧（ROS）水平和线粒体功能。
方法论
实验在塞阿拉州立大学（UECE，福塔莱萨，巴西）的细胞培养、生物化学和基因表达实验室（LABIEX）进行。本研究已获得动物使用伦理委员会的批准（CEUA/UECE批准号：12023582/2022）。
AECS中尼古丁含量的检测
对香烟烟雾水提取物（AECS）的色谱分析证实其中含有尼古丁，浓度为158.40 μg/mL。据此计算出实验组中1%、2.5%和5% AECS中的尼古丁含量分别为1.584 μg/mL、3.96 μg/mL和7.92 μg/mL（见图1）。
原子力显微镜
图2展示了尼古丁水提取物的形态学特征，包括振幅图像（10×10 μm，图2A）和三维拓扑结构图像（10×…）
讨论
本研究首次描述了香烟烟雾水提取物（AECS）对牛卵母细胞体外成熟（IVM）的影响。化学分析显示AECS中含有高浓度的尼古丁，这是引发吸烟不良效应的主要原因。此外，我们认为尼古丁与其他AECS中的成分之间存在协同作用。
已有证据表明AECS会促进细胞核的…（原文此处内容不完整）
结论
综上所述，香烟烟雾水提取物中的化合物（包括尼古丁）会对牛卵母细胞产生细胞毒性。综合考虑所有实验结果，可以明确这些化合物会导致雌性配子的退化。因此，需要进一步研究以阐明这些化合物的作用机制，因为这些机制尚未完全明了。
作者贡献
AKCA和VRA设计了研究方案并撰写了论文；AKCA和SDM参与了实验工作；LMCV负责HPLC分析；ARAN进行了AFM分析；VMC提供了实验所需的实验室设施。
资金支持
不适用
CRediT作者贡献声明
瓦尼亚·马里兰德·塞卡托（Vania Marilande Ceccatto）： 提供研究资源。瓦尔德瓦内·罗查·阿劳茹（Valdevane Rocha Araújo）： 负责写作、审稿与编辑、初稿撰写、项目管理、方法设计、数据整理及概念框架构建。莱兹·玛丽亚·科斯塔·维拉斯（Leiz Maria Costa Véras）： 负责数据分析。阿琳·罗德里格斯·德·阿劳茹·诺布雷（Alyne Rodrigues de Araújo Nobre）： 负责数据分析。安娜·卡伦·德·卡瓦略·阿尔布克尔克（Ana Karen de Carvalho Albuquerque）： 负责初稿撰写、方法设计及数据分析。索拉诺·丹塔斯·马丁斯（Solano Dantas Martins）： 负责写作、审稿与编辑、初稿撰写、方法设计及实验设计。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢帕尔纳伊巴德尔塔联邦大学（Parnaíba Delta Federal University）的生物多样性与生物技术研究中心（BIOTEC）提供的HPLC和AFM分析支持。V.R. Araújo获得了国家科学技术发展委员会（CNPq）的博士后奖学金。
