自噬调控的线粒体遗传决定CD8+T细胞早期命运抉择

《Nature Cell Biology》：Autophagy-regulated mitochondrial inheritance controls early CD8+ T cell fate commitment

本研究针对T细胞免疫随年龄增长而衰退，伴随自噬和不对称细胞分裂能力下降的问题，开展了关于自噬调控CD8+T细胞线粒体遗传及其对早期命运决定影响的研究。研究人员利用新型MitoSnap小鼠模型，首次证实自噬缺陷T细胞无法清除有丝分裂前的旧线粒体并导致其对称性遗传；而自噬功能正常的细胞通过不对称分裂产生命运迥异的子代细胞：继承旧线粒体的细胞记忆潜能低，而未继承旧线粒体、线粒体更新快的细胞则具有长期存活和强再扩增能力。多组学分析表明，这一早期命运分歧由不同的代谢程序驱动，其中保留有丝分裂前线粒体的细胞激活了一碳代谢。该发现深化了对T细胞多样性早期印记机制的理解，为调控T细胞功能的新策略开发提供了理论支持。

　　

随着岁月流逝，我们的免疫系统会逐渐衰老，其中T细胞功能的衰退尤为突出。这背后隐藏着两个关键生物学过程的减弱：细胞自噬（Autophagy）和不对称细胞分裂（Asymmetric Cell Division, ACD）。自噬是细胞内部的“清洁工”，负责降解受损的细胞组分，包括功能失调的线粒体（即线粒体自噬，Mitophagy）。而不对称细胞分裂则像一个“分拣系统”，使得一个母细胞分裂时，能将不同的细胞“货物”（如蛋白质、细胞器）不均等地分配给两个子细胞，从而直接促成细胞命运的早期分化。在适应性免疫的主力军——CD8⁺T细胞中，一个初始T细胞（Naive T cell）被激活后，其子代细胞会分化为功能各异的两大类：短寿的效应T细胞（Effector T cells），负责直接杀伤被感染的细胞；以及长寿的记忆T细胞（Memory T cells），它们长期存活，并在再次遇到相同抗原时能快速扩增，是疫苗有效性的核心。然而，关于记忆T细胞是如何形成的，以及这些早期命运决定在何时、以何种方式被“烙印”在细胞中，科学界仍存在许多疑问。尤其是在衰老过程中，T细胞记忆功能严重受损，积累了大量具有DNA损伤、细胞周期停滞、线粒体功能障碍等特征的衰老T细胞亚群。因此，揭示自噬和不对称细胞分裂在T细胞早期命运决定中的具体作用机制，对于理解免疫衰老、改善老年免疫应答以及开发新的免疫疗法至关重要。

为了回答这些悬而未决的问题，由Mariana Borsa和Anna Katharina Simon领导的研究团队在《Nature Cell Biology》上发表了一项突破性研究。他们首次将自噬、不对称细胞分裂和一种特定的细胞器——线粒体的遗传联系起来，并令人信服地证明了线粒体作为“命运决定因子”在CD8⁺T细胞第一次分裂时的不对称遗传，直接决定了子代细胞是走向效应命运还是记忆命运。

本研究主要采用了以下几种关键技术方法：研究人员构建了一种新型的基因工程小鼠模型——MitoSnap模型（Omp25-SnapTag^fl/flErt2Cre），该模型允许通过他莫昔芬诱导，在CD8⁺T细胞的线粒体膜蛋白OMP25上表达SNAP-Tag。SNAP-Tag能够共价、特异性地结合细胞膜通透性荧光底物，从而实现对有丝分裂前（pre-mitotic, preM）的“旧”线粒体和有丝分裂后（post-mitotic, postM）新合成的“年轻”线粒体进行顺序标记和追踪。结合流式细胞术分选（FACS）、共聚焦显微镜、蛋白质组学、单细胞转录组测序（scRNA-seq）、靶向代谢组学、代谢通量分析（使用¹³C标记的葡萄糖和丝氨酸）以及过继性T细胞转移（Adoptive Cell Transfer）模型（采用OVA特异性OT-I TCR转基因T细胞和表达OVA的李斯特菌LM-OVA感染模型）等多种技术，系统深入地探讨了线粒体遗传模式对T细胞命运的影响。

研究结果

自噬调控CD8⁺T细胞有丝分裂中差异蛋白质组和线粒体不对称遗传

研究人员首先通过蛋白质组学分析首次分裂后产生的CD8^hi（效应样）和CD8^lo（记忆样）子代细胞，发现许多与代谢和线粒体功能/生物发生相关的蛋白存在不对称遗传。特别是，CD8^hi细胞继承了更多产生活性氧（ROS）的线粒体，而这些线粒体是自噬的靶标。通过诱导性敲除自噬关键基因Atg16l1，他们证实自噬的缺失废除了产超氧化物线粒体的不对称遗传。此外，自噬机制本身（如LC3B-II）在细胞分裂时也呈现极化分布，并随衰老而变得对称。蛋白质组比较进一步显示，自噬缺陷或衰老的CD8⁺T细胞中，差异遗传的蛋白质数量减少，尤其是线粒体相关蛋白。这些发现凸显了自噬在建立不对称遗传模式中的关键作用。

旧线粒体的分离依赖于自噬

为了直接追踪线粒体的遗传，研究团队利用了MitoSnap模型。他们可以在T细胞激活后的特定时间点，先后用不同颜色的荧光底物标记preM（旧）和postM（年轻）线粒体。结果发现，尽管总线粒体质量在子代细胞间分布均匀，但preM/旧线粒体被不对称地分配，优先进入CD8^hi子代细胞。而在自噬缺陷的T细胞中，旧线粒体和年轻线粒体都会被保留多个分裂周期，表明线粒体更新受损，并且旧线粒体的不对称分离被废除。这一定位自噬是连接细胞器质量控制和ACD过程中命运决定因子不对称遗传的关键机制。

线粒体自噬驱动继承异质性线粒体群细胞后代的出现

通过比较继承高量（MitoSnap^hi）或低量（MitoSnap^lo）旧线粒体的子代细胞的命运，研究人员发现，自噬功能正常的WT细胞中，原本MitoSnap^hi的细胞会转变为MitoSnap^lo，而自噬缺陷的细胞则大部分保留其标记。使用巴弗洛霉素A（BafA）抑制自噬流或CCCＰ诱导线粒体自噬的实验证实，MitoSnap^lo细胞的产生依赖于自噬/线粒体自噬介导的降解。对分离的线粒体进行流式分析（MitoFlow）发现，自噬缺陷细胞中线粒体平均更大、异质性更低，且 brightly labelled 的preM/旧结构比例显著高于WT细胞。这些结果表明，MitoSnap^lo细胞的出现既依赖于不对称分离，也依赖于降解事件，而自噬在两种机制中都发挥作用。

更快的线粒体更新预示记忆性CD8⁺T细胞分化

为了探究旧线粒体继承是否影响体内T细胞命运，研究人员使用了OT-I MitoSnap模型。发现在体内免疫应答中，异质性线粒体遗传同样存在：MitoSnap^lo细胞更频繁地出现在记忆前体（CD127⁺）中，而MitoSnap^hi细胞则高表达颗粒酶B。更重要的是，过继转移分选出的MitoSnap^lo和MitoSnap^hi第一代子细胞后，用LM-OVA进行攻击实验显示，MitoSnap^lo细胞的后代表现出更强的存活能力和再扩增潜能。在记忆阶段，MitoSnap^lo细胞频率更高，且能产生更多的IFN-γ和TNF。利用Tat-Cre系统进行的独立验证也得到类似结果。这些发现表明，继承低量旧线粒体、线粒体更新快的细胞具有更优的记忆潜能。

线粒体遗传模式控制T细胞命运决定

对分选的MitoSnap^hi和MitoSnap^lo细胞的分析显示，它们的代谢、存活和增殖能力存在差异。MitoSnap^hi细胞具有更高的全局翻译速率，且更依赖于糖酵解和氧化磷酸化，ATP产量也更高。其线粒体网络更复杂、体积更大、融合程度更高，这些特征有助于抵抗自噬降解并维持OXPHOS能力。在细胞因子存在下，MitoSnap^hi细胞增殖更快、更均一，但在细胞因子限制条件下存活率较低，表现出效应细胞特征。相反，MitoSnap^lo细胞翻译速率低，慢分裂细胞比例高，CD62L表达高，在无抗原刺激下存活能力更强，呈现记忆细胞表型。自噬缺陷细胞则无论线粒体继承情况如何，存活和增殖都较差。

线粒体群的不平等遗传驱动CD8⁺T细胞转录组和蛋白质组变化

蛋白质组学分析发现，MitoSnap^lo细胞富集与基因组稳定性（如WRN）和线粒体呼吸链（如mt-ND4）相关的蛋白，而MitoSnap^hi细胞则富集与mTOR代谢（如HIF1α, LAMTOR2）和细胞周期进程相关的蛋白。单细胞转录组学将细胞分为9个簇，其中MitoSnap^lo细胞富集于具有记忆相关特征（如Tcf7/TCF1, Sell/CD62L）和线粒体功能/生物发生特征的簇；而MitoSnap^hi细胞则更多分布于与效应功能、细胞周期和营养摄取（如丝氨酸转运蛋白Slc1a5/SLC1A5）相关的簇。伪时间分析清晰显示MitoSnap^hi细胞更倾向于分化为终末分化细胞。这些分析表明，不对称线粒体遗传导致了 divergent metabolic and transcriptional programme。

维持旧线粒体触发一碳代谢

转录组学分析发现一个与一碳（1C）代谢（如Mthfd2, Phgdh, Shmt2）相关的簇主要由MitoSnap^hi细胞组成。通过Scenith assay抑制1C代谢关键酶（SHMT1/2, MTHFD1/2, PHGDH），证实MitoSnap^hi细胞的翻译速率显著受抑制，而MitoSnap^lo细胞受影响小。共聚焦显微镜显示，高表达旧OMP25-SnapTag的线粒体也表达更多的SHMT2酶。在丝氨酸（Ser）和甘氨酸（Gly）剥夺条件下培养，MitoSnap^hi细胞的存活率增加，效应样表型（CD44⁺CD25⁺）频率下降。代谢组学和¹³C通量分析进一步证实，MitoSnap^hi细胞中丝氨酸和甘氨酸的丰度及其从¹³C-葡萄糖或¹³C-丝氨酸的碳汇入更高，而这种差异在自噬缺陷细胞中基本消失。这表明1C代谢的激活与继承旧线粒体密切相关，且依赖于线粒体更新。

研究结论与意义

本研究首次提供了令人信服的证据，将一种明确的有丝分裂前细胞“货物”——线粒体的不对称遗传，与免疫细胞的命运决定直接联系起来。研究人员利用创新的MitoSnap模型，成功区分了线粒体的分离、降解和生物合成事件，克服了以往使用染料或表面标记物的局限性。

研究结论可归纳为以下几点：

1. 1.
   自噬是CD8⁺T细胞第一次分裂时实现线粒体不对称遗传的必要条件。自噬缺陷或衰老会导致旧线粒体对称遗传和滞留。
2. 2.
   线粒体自噬（Mitophagy）和不对称细胞分裂（ACD）协同作用，共同促进细胞命运决定因子的早期不对称遗传，从而产生MitoSnap^lo（记忆样）和MitoSnap^hi（效应样）子代细胞。
3. 3.
   继承低量旧线粒体、线粒体更新快的MitoSnap^lo细胞在体内外均表现出更优的记忆潜能：更好的长期存活、更强的再扩增能力和效应细胞因子产生能力。
4. 4.
   线粒体遗传模式通过影响细胞的代谢状态（如对糖酵解的依赖、1C代谢的激活）来驱动T细胞命运分歧。继承旧线粒体的细胞代谢更活跃，倾向于效应命运；而线粒体更新快的细胞则更静息，倾向于记忆命运。
5. 5.
   一碳（1C）代谢是MitoSnap^hi效应样细胞的一个关键代谢特征，可能成为调控T细胞分化的潜在靶点。

这项研究的发现具有深远的意义。它不仅深化了我们对T细胞多样性早期起源的理解，更重要的是，它将细胞器质量控制（自噬）、细胞分裂模式（不对称分裂）和细胞代谢重编程有机地联系起来，为免疫细胞命运决定提供了一个全新的、机制性的框架。在衰老研究中，该发现为解释年龄相关的T细胞功能衰退（免疫衰老）提供了新的视角，即自噬和ACD的双重下降导致线粒体更新减慢和对称遗传，进而损害了记忆T细胞的生成。从转化医学的角度看，这些发现提示，调控T细胞功能的手段可能需要考虑干预的时机：在有丝分裂前进行干预可能全局影响T细胞分化，而在有丝分裂后干预则可能选择性靶向某一特定亚群（如增强记忆或抑制效应功能），这为开发更精准的免疫疗法（如用于癌症免疫治疗、疫苗设计或抗衰老干预）开辟了新的途径。