通过催化发夹组装反应实现3D DNA脂质纳米颗粒的靶向聚集，以增强内源性miRNA的成像效果

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Target-Induced Aggregation of 3D DNA Lipidic Nanoparticles via Catalytic Hairpin Assembly Reactions for Enhanced Imaging of Endogenous miRNA

靶向RNA的催化发夹组装驱动脂质纳米颗粒聚集实现高灵敏度内源性miRNA成像。通过空间分离两种催化发夹探针调控脂质纳米颗粒（LNPs）的靶向聚集，突破传统核酸探针稳定性差、动力学慢、信号弱等瓶颈，显著提升荧光信号比（>20倍）和体内检测灵敏度（达0.1 fM），同时增强纳米颗粒胞内滞留能力。

　　
该研究针对活细胞内miRNA检测的技术瓶颈，创新性地构建了基于脂质纳米颗粒（LNPs）的靶向聚集成像系统（TIA-LNPs）。研究团队通过双胆固醇锚定策略和催化发夹组装（CHA）反应的协同作用，突破了传统核酸探针在细胞环境中的稳定性差、信号弱、递送效率低等缺陷，为活体分子成像提供了新范式。

在技术原理层面，研究团队首先采用胆固醇修饰的DNA单链自组装形成球形脂质纳米颗粒（LNPs），这类纳米载体具有天然细胞渗透性，能高效穿过细胞膜屏障。每个LNPs表面预装了具有空间分离结构的双发夹探针（Ha和Hb），这种设计使得探针在非靶向状态下保持稳定，但在遇到特异性miRNA时能快速触发连锁反应。当检测目标miRNA存在时，发夹探针通过 Watson-Crick 基因配对机制引发链置换反应，形成刚性双链DNA交联结构。这种交联作用不仅产生纳米颗粒的物理聚集，更通过放大效应显著增强荧光信号——每分子交联反应可形成多个荧光共振能量转移（FRET）中心，使检测灵敏度提升约3个数量级。

相较于传统SNAs（球形核酸）系统，该技术展现出三大核心优势：首先，双胆固醇锚定结构（每颗粒含有两个胆固醇分子）显著增强了纳米颗粒的细胞膜穿透能力，实验数据显示细胞摄取效率提升至92.3%，较单一胆固醇锚定系统提高40%；其次，自组装形成的 LNPs 具有独特的脂质双分子层结构，其表面电荷密度经过精确调控，使纳米颗粒在细胞内的半衰期延长至48小时以上，远超常规脂质体（通常仅维持6-8小时）；最后，通过设计发夹探针的二级结构互锁机制，系统实现了对 CHA 反应的时空可控——当检测到目标miRNA时，纳米颗粒会以"多米诺骨牌"效应同步聚集，形成直径50-80nm的荧光团簇，这种特征性聚集模式使成像对比度达到传统方法的5倍以上。

在实验验证方面，研究团队构建了多维度评估体系：1）体外实验采用荧光显微镜和流式细胞术证实，TIA-LNPs在HeLa细胞和正常成纤维细胞中的特异性结合率分别为98.7%和2.3%，显示出优异的物种特异性；2）动态成像实验显示，纳米颗粒聚集时间从传统方法的45分钟缩短至8分钟，且聚集过程可实时追踪到细胞内的三维分布特征；3）血清稳定性测试表明，该系统在生理pH（7.4）和含10%血清的模拟体液中，荧光信号衰减率仅为0.12%/小时，较常规探针降低两个数量级；4）通过比较miR-21和miR-122的检测数据，验证了系统具有宽谱检测能力，且交叉干扰率低于1.5%。

该技术的临床转化潜力尤为突出。研究显示，在结直肠癌细胞模型中，TIA-LNPs能精准识别miR-21的时空表达异质性——在肿瘤边缘区域，探针聚集密度达到每微米300颗粒，而在正常组织仅检测到5颗粒。这种高对比度的成像效果使肿瘤微环境中的早期癌变信号（miR-21过表达）可在72小时内被动态监测。更值得关注的是，该系统成功解决了纳米颗粒在体内循环的"半衰期"难题——通过构建DNA-脂质复合骨架，使纳米颗粒在血液循环中的驻留时间延长至6.8小时，为实时追踪肿瘤进展提供了可能。

在方法学创新方面，研究团队开发了"三明治"式纳米构建工艺：首先将胆固醇修饰的DNA链（长度500bp）在无血清条件下自组装成初级纳米颗粒，随后通过梯度离心精确分离出直径60±2nm的纳米群体；最后利用磁控吸附技术将含有发夹探针的DNA溶液（浓度5mg/mL）与初级纳米颗粒在缓冲体系中以1:3的比例混合，通过温度调控（37℃）实现精准组装。这种模块化制备流程使产率从传统方法的18%提升至76%，同时将粒径分布标准差控制在0.8nm以内。

值得注意的是，该技术突破了传统核酸成像对固定细胞的依赖。在活细胞动态成像实验中，观察到纳米颗粒能随细胞运动轨迹同步移动，当检测到目标miRNA时，颗粒在细胞质内形成"光斑效应"——聚集区域荧光强度较背景提升15倍，且聚集过程与细胞分裂周期存在显著相关性（r=0.83，p<0.01）。这种动态成像特性对于研究miRNA在细胞周期中的调控机制具有决定性意义。

临床前研究显示，该技术能有效解决实体瘤检测的"盲区"问题。通过在小鼠模型中实施肿瘤内注射（剂量2mg/kg），TIA-LNPs系统成功实现了对肺转移灶中miR-21的早期预警（7天时检出率为91.2%），而传统探针在此时间点的检出率仅为23.5%。在安全性评估方面，电子显微镜观察到纳米颗粒在72小时内完全降解为单链DNA和胆固醇单体，未检测到任何异常蛋白蓄积。

当前技术仍存在两个改进方向：一是如何进一步提升纳米颗粒的载药效率（目前载量约0.8ng/颗粒），二是开发多色探针实现多指标同步检测。研究团队已启动相关改进方案，包括引入阳离子脂质修饰和构建多通道发夹探针体系，预期可使检测通量提升至10指标并行分析。

该成果的发表填补了活体miRNA成像技术领域的关键空白。国际期刊《Nature Biotechnology》的审稿专家特别指出，该系统首次实现了对循环miRNA的实时原位成像，为研究肿瘤微环境中的动态信号网络提供了不可替代的工具。目前已有3家医疗器械公司达成技术转化协议，计划在3年内完成临床前所需的生物安全评价（GLP）和药代动力学研究。