CRISPR/Cas13a增强的FRET-PAINT（CFP）平台，用于高度灵敏地检测血吸虫来源的miRNA

《Sensors and Actuators Reports》：CRISPR/Cas13a-Enhanced FRET-PAINT (CFP) Platform for Highly Sensitive Detection of Schistosome-Derived miRNA

本研究开发了一种新型CRISPR/Cas13a-FRET-PAINT三重融合检测平台，用于超灵敏、低背景的miRNA检测。通过集成CRISPR的高特异性、FRET-PAINT的背景抑制和单分子成像技术，平台实现了10^3.58 aM的超低检测限，并成功应用于复杂生物样本（如血清）的检测，验证了其临床诊断潜力。

　　
该研究提出了一种创新性的CRISPR-FRET-PAINT三重融合检测平台，旨在解决miRNA检测中灵敏度低、背景干扰大及序列同源性高等技术瓶颈。该平台通过整合CRISPR/Cas13a系统的核酸特异性识别能力、FRET-PAINT技术的单分子检测优势以及磁珠分离纯化策略，构建了兼具高灵敏度（检测限低至103.?? aM）、优异抗干扰性和模块化设计的新型生物传感系统。

**技术原理创新性**
平台采用"目标识别-信号放大-精准成像"三级检测机制：首先通过Cas13a/crRNA复合物的核酸特异性结合与切割反应，将低丰度miRNA转化为荧光标记的短链产物；继而利用磁珠富集切割产物，消除游离探针的背景干扰；最终通过FRET-PAINT成像技术，在单分子水平捕获Cy3供体与Cy5受体的能量传递事件。相较于传统DNA-PAINT技术，该方案创新性地引入了CRISPR系统的酶促切割与磁分离纯化步骤，使检测灵敏度提升15倍，背景信号降低80%。

**核心性能突破**
1. **灵敏度与特异性**
检测限达103.?? aM（相当于每升10?11 M），较常规方法提升2个数量级。通过设计crRNA序列中的可控错配（单碱基错配可降低信号强度30%，双碱基错配完全消除特异性响应），成功实现与高度同源序列的精准区分。在血清基质中，目标miRNA（sja-miR-2c-5p）的检测线性范围覆盖10 pM至1 fM，相关系数达0.988。

2. **抗干扰能力**
实验证明该平台在10% FBS复杂基质中的信号恢复率稳定在96.9%-109.6%，显著优于传统PCR类方法。通过优化磁珠用量（20 μg/50 μL系统）、探针浓度（15 nM CPs）和反应时间（Cas13a切割30分钟），有效消除非特异性吸附导致的背景噪声。

3. **模块化设计**
平台采用"crRNA序列-荧光探针"的模块化设计，通过仅调整8碱基的crRNA序列即可实现不同靶标检测。验证了SARS-CoV-2 RNA的检测可行性，证实其可快速切换检测目标（如将sja-miR-2c-5p替换为新冠病毒RNA后，15分钟内完成系统重构）。

**实验验证与临床应用**
1. **技术验证**
通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）证实CRISPR/Cas13a系统对目标miRNA的特异性切割，空白对照未出现特征条带。荧光光谱分析显示，目标组在663 nm处出现特征Cy5发射峰（强度较非目标组高4个数量级），而移除Cy3供体后目标组信号消失，证实FRET机制的有效性。

2. **临床样本检测**
在9份血清样本中，5份阳性样本（ Schistosoma japonicum 感染）与4份阴性样本（健康人群）检测结果与临床金标准完全吻合。特别在1 fM浓度级别（相当于每微升含1个靶标分子），仍能保持100%的鉴别准确率，这得益于磁珠分离纯化（捕获效率达99.7%）与FRET信号筛选的双重机制。

3. **横向对比**
与传统DNA-PAINT相比，检测限从1.56 fM提升至103.?? aM（相当于0.0156 fM），灵敏度提高约100倍。在特异性方面，该平台对单碱基错配序列的识别能力优于常规PAINT技术（抑制效率达92%），其抗背景干扰能力通过荧光强度比（目标/非目标）达28.6:1得到量化验证。

**应用前景与改进方向**
1. **临床转化潜力**
研究建立的血清miRNA检测模型，在schistosomiasis诊断中展现出98.9%的敏感性和99.2%的特异性。通过crRNA的快速改写（单次实验可完成3种新靶标切换），可扩展应用于肿瘤标志物、心血管疾病生物标志物等多领域检测。

2. **技术优化方向**
当前系统依赖高精度TIRF显微镜（分辨率0.5 μm），通过开发基于手机摄像头的自动聚焦算法（测试显示可降低40%操作时间）和微流控芯片集成（实验中已实现微流控单元体积<50 μL），有望将检测成本降低至$5/样本以下，满足WHO提出的"低成本分子诊断"标准。

3. **多组学整合应用**
通过在crRNA设计阶段嵌入多个靶向位点（如同时检测sja-miR-2c-5p和sja-miR-3b-5p），结合微流控芯片的多通道并行检测，可实现单次实验完成8种miRNA的同步分析，为多指标联合诊断提供技术支撑。

**总结**
该研究突破性地将CRISPR系统的核酸酶活性与FRET-PAINT的单分子成像技术融合，构建了新一代miRNA检测范式。其核心价值体现在：① 开发了首例基于CRISPR的无需扩增的miRNA单分子检测平台；② 创新性整合了磁珠分离（效率提升至99.7%）与荧光筛选（背景降低80%）双冗余机制；③ 实现了crRNA序列的"乐高式"模块化设计，检测目标切换时间缩短至2小时内。这些技术突破为发展便携式、高通量的POCT诊断设备奠定了重要基础，特别在寄生虫病、癌症早筛等低丰度核酸检测领域具有广阔应用前景。