《Sensors and Actuators B: Chemical》：Design of haptens, antibody preparation, and immunoassay development for Nimesulide on-site detection
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尼美舒利残留快速检测方法开发及性能验证，基于计算机模拟设计三种不同碳链长度的半抗原（C0/C4/C6），成功筛选出高敏感单克隆抗体（4D7抗体检出限0.014 ng/mL牛奶和0.042 ng/mL功能饮料），并通过LC-MS/MS验证检测有效性，为复杂基质中非法添加物筛查提供新工具。
Jiarui Wang|Lingling Guo|Liqiang Liu|Hua Kuang|Chuanlai Xu|Yingyue Zhu|Liguang Xu
国际生物界面与生物检测联合研究实验室，江南大学食品科学与技术学院，中国江苏省无锡市，214122
摘要
尼美舒利（Nimesulide，简称Nim）是一种非甾体抗炎药，被批准用于治疗人类和牲畜，但在监管不足的地区，它也被非法添加到食品和功能性饮料中。研究表明，含有Nim的补充剂可能导致肝脏损伤，这突显了快速检测的必要性，以降低与Nim残留相关的风险。本文首次描述了一种用于检测Nim的视觉免疫层析法（VICA）。通过优化计算机模拟，设计并合成了三种不同长度的间隔臂（C0、C4和C6）的新型Nim半抗原。通过筛选多种细胞系中的抗原，成功获得了一种高灵敏度的单克隆抗体4D7（IC50 = 0.18 ng/mL）。该检测方法在牛奶中的检测限为0.014 ng/mL，在功能性饮料中的检测限为0.042 ng/mL。实际样品的检测结果经仪器验证，证实了该方法在检测食品中Nim残留方面的有效性。
引言
尼美舒利（Nim）是一种非甾体抗炎药（NSAID），具有抗炎、镇痛和退烧作用[12]、[36]、[4]、[5]。然而，由于治疗期间的滥用或停药期不当，Nim的残留问题引起了关注。此外，Nim还与肝毒性和胃肠道损伤有关，对人类健康构成重大威胁[31]、[35]。最近的环境监测研究在葡萄牙的废水排放物中发现了微量的Nim，浓度达到6.91 ng/L[22]，并在拉丁美洲的城市水源中检测到了Nim残留[25]。此外，在地中海的贻贝中检测到了高达100 ng/g的Nim残留，表明像Nim这样的NSAIDs可以通过人类活动和水源进入生物体[21]。欧洲药品管理局确认了Nim治疗急性疼痛的有效性，但指出其肝毒性风险高于其他NSAIDs。丹麦食品管理局的一份报告记录了一名女性在摄入含有Nim的食品补充剂后出现毒性肝炎的情况，这表明食品补充剂的成分很少经过毒理学检测，通常只评估其急性效应，从而引发了人们对潜在药物掺假的担忧[27]。因此，建立检测Nim残留的分析方法至关重要。
已经开发了多种方法来检测样品中的Nim残留[18]、[19]、[32]、[34]、[6]。例如，开发了一种基于液态金属的电化学传感器，用于检测尿液和河水中的Nim，检测限为1.09 nM[23]；还有一种用于检测药品制剂、自来水、合成尿液和母乳中Nim的方法，检测限为0.018 μmol/L[24]；以及一种基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的方法，用于检测牛奶中的Nim，检测限为0.05 ng/mL[13]。然而，这些方法存在一些缺点。在复杂基质（如牛奶和草药茶）中检测目标物质时，LC-MS/MS需要繁琐的纯化步骤。此外，电化学方法依赖于电极修饰和信号放大技术，稳定性较差，且需要高质量的实验环境，这些限制影响了其在现场快速筛查中的应用。
视觉免疫层析法（VICA）是一种用于目标物质快速现场筛查的分析方法，但尚未应用于检测Nim残留。与传统方法相比，VICA在即时现场检测方面具有显著优势[10]、[30]、[7]：首先，操作简便，颜色变化可在10到15分钟内用肉眼观察到；其次，VICA的试纸制备过程非常稳定，便于储存和运输；此外，VICA所需的样品预处理步骤最少，可以直接检测复杂基质中的目标物质。总体而言，VICA在速度和便携性方面表现优异，是确保食品安全的快速筛查首选技术。
值得注意的是，VICA的灵敏度和特异性较低。因此，对半抗原进行了改进设计。在传统的半抗原设计中，间隔臂的长度通常被认为是影响抗体亲和力和灵敏度的关键因素。此外，将半抗原连接到载体蛋白的偶联策略直接影响免疫原的表位暴露和抗体的生成效率。在本研究中，合成了三种具有不同间隔臂长度的Nim半抗原（Nim1–Nim3），并使用具有不同偶联部位的半抗原构建了免疫原和包被抗原。这种方法旨在产生适用于VICA试纸开发的高性能单克隆抗体（mAbs）。
本研究的目的是开发一种高灵敏度、快速的检测食品中Nim残留的技术。基于计算机模拟设计了三种具有不同间隔臂长度的抗Nim半抗原，并筛选出具有高亲和力和特异性的单克隆抗体。所开发的VICA试纸能够有效检测牛奶和功能性饮料中的Nim残留，其检测结果与LC-MS/MS方法高度一致。
部分内容摘要
化学品和材料
所有化学试剂和生物材料均来自纯度最高的商业供应商（>98%）。目标分析物N-(4-氨基-2-苯氧基苯)甲磺酰胺（Nim）及其结构类似物（氟美他林、塞来昔布、酮洛芬、芬普罗芬、西那普罗芬、普拉诺普罗芬和伊古拉替莫）由上海BiDe PharmaTech有限公司提供。半抗原Nim1：N-(4-氨基-2-苯氧基苯)甲磺酰胺由北京百灵威科技有限公司提供。
尼美舒利半抗原的设计
本研究重点设计了Nim的半抗原（图2A），通过计算模拟和多方面分析来研究不同间隔臂长度对构建高亲和力单克隆抗体的影响。首先，在保留Nim磺酰胺基团的关键结构的基础上，将硝基替换为氨基，并引入了四碳和六碳链的羧基连接臂，以构建三种半抗原
结论
抗原的结构设计直接影响抗体的性能。本研究调查了间隔臂长度（抗原偶联的关键参数）对检测Nim残留的影响。三种具有不同间隔臂长度的新型Nim半抗原（Nim1/2/3）经过结构优化，并通过计算机辅助模拟进行了免疫学实验。有趣的是，尽管传统理论认为间隔臂的长度是主要决定因素
CRediT作者贡献声明
Liqiang Liu：项目监督、项目管理、方法学设计、实验研究。Lingling Guo：结果验证、方法学设计、实验研究、数据管理。Chuanlai Xu：初稿撰写、数据可视化、结果验证、项目监督、实验研究、资金申请。Hua Kuang：项目监督、项目管理、方法学设计、实验研究、概念构思。Liguang Xu：初稿撰写与编辑、数据可视化、结果验证、项目监督、方法学设计
致谢
本研究得到了“青年教师科研创新能力支持项目”（ZYGXQNJSKYCXNLZCXM-H11）和中国国家自然科学基金（项目编号32471430和32372436）的资助。
Jiarui Wang目前是江南大学的博士候选人，她的研究方向是危险化学物质的快速检测与分析。
