COVID-19脓毒症纵向基因表达分析揭示重症患者动态免疫、细胞与代谢失调

《Scientific Reports》：Longitudinal gene expression analysis in COVID-19 sepsis highlights dynamic immune, cellular, and metabolic dysfunction in high severity patients

本研究针对COVID-19患者病程中免疫和细胞功能动态变化机制不清的问题，通过128例住院患者的300份血液样本进行纵向转录组分析，发现重症患者存在显著免疫抑制、炎症反应和代谢紊乱特征，并鉴定出阶段特异性基因签名及潜在老药新用方案（如达沙替尼、二甲双胍），为脓毒症精准分型和时间依赖性治疗提供新策略。

　　

当新冠病毒（SARS-CoV-2）席卷全球时，临床医生面临着一个巨大挑战：为什么有些COVID-19患者会迅速发展为危及生命的重症，而其他患者则症状轻微？更复杂的是，同一位患者在住院期间病情也可能急剧变化。科学家们逐渐认识到，严重的COVID-19本质上是一种病毒性脓毒症，其病理过程涉及免疫系统和细胞功能的剧烈波动，表现为时而过度炎症、时而免疫抑制的动态过程。然而，目前大多数研究要么样本量小，要么只关注疾病某个时间点，缺乏对患者整个住院期间基因水平变化的系统描绘。这限制了我们理解疾病进展机制的能力，也阻碍了针对不同疾病阶段开发精准治疗策略的进程。

为了填补这一空白，由加拿大不列颠哥伦比亚大学的Robert E. W. Hancock教授领导的研究团队进行了一项深入的纵向研究。他们分析了来自128名住院COVID-19患者的300份全血样本，这些样本在其住院期间（最长至入院后43天）的不同时间点采集。利用转录组测序（RNA-Seq）等先进技术，研究人员旨在绘制COVID-19疾病轨迹中基因表达的动态图谱，揭示关键病理生理过程，并探索潜在的阶段特异性治疗方法。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，题为“Longitudinal gene expression analysis in COVID-19 sepsis highlights dynamic immune, cellular, and metabolic dysfunction in high severity patients”。

研究人员主要运用了几项关键技术方法。研究队列和样本来源于加拿大魁北克COVID-19生物样本库（BQC-19），包括128名成年住院患者的300份纵向全血样本。他们根据序贯器官衰竭评估（SOFA）评分和是否入住重症监护室（ICU）等临床标准，将样本划分为六个不同的疾病阶段（轻、中、重、危重、恢复、出院）。通过RNA测序（RNA-Seq）获取全转录组表达数据后，利用DESeq2进行差异基因表达分析。为了解读差异表达基因的生物学意义，他们使用了SIGORA（基于基因对的通路富集分析）和MSigDB数据库中的Hallmark基因集进行通路富集分析。此外，还利用药物签名数据库（DSigDB）进行了药物-基因集富集分析，以预测可能被重新用于治疗的已上市药物。为了开发能够区分疾病阶段的工具，研究人员采用了最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归来构建凝练的基因签名，并通过基因集变异分析（GSVA）来评估这些签名的分类效能。最后，他们还研究了这些疾病阶段与之前定义的脓毒症内型（Endotype）之间的关联。

疾病阶段的划分与验证

研究团队首先建立了一个框架，将300个样本划分为六个疾病阶段：轻度（Mild）、中度（Moderate）、重度（Severe）、危重（Critical）、恢复期（Recovery）和出院期（Discharge）。划分不仅依据SOFA评分所反映的器官功能障碍严重程度，还考虑了患者是否入住ICU以及疾病的总体轨迹（例如，SOFA评分是否呈下降趋势，或是否即将从ICU转出）。分析显示，与健康对照（患者出院后3-7个月的随访样本）相比，每个阶段的差异表达基因（DEG）数量存在显著差异，从轻度阶段的2003个逐渐增加至危重阶段达到顶峰的8542个，随后在恢复期和出院期逐渐减少。这表明基因表达的紊乱程度与疾病严重程度平行，并在恢复过程中趋于正常。主成分分析（PCA）也证实了这种划分的合理性，重度（Severe）和危重（Critical）阶段的样本聚集在一起，而其他严重程度较低的阶段则与对照组更接近。

不同疾病阶段的分子通路特征

通路富集分析揭示了随着疾病进展，被激活或抑制的分子通路呈现出清晰的动态变化模式。

1. 1.
   早期抗病毒反应：干扰素（Interferon, IFN）信号通路（如“Interferon alpha/beta signaling”）和相关基因集（如“Interferon-α Response”）在疾病早期（轻度到危重阶段）显著富集于上调基因中，但在恢复期和出院期不再富集。这表明机体针对病毒的先天免疫反应在疾病初期被迅速激活，但随着病情发展或进入恢复期，其活性逐渐减弱。
2. 2.
   进行性免疫失调：与早期强烈的抗病毒反应形成对比的是，适应性免疫功能在疾病中后期表现出明显的抑制。例如，涉及免疫调节相互作用（“Immunoregulatory Interactions”）、DAP12信号（与NK细胞和髓系细胞活化有关）、MHC II类抗原提呈（“MHC class II Antigen Presentation”）以及T细胞信号（如“IL2 STAT5 Signaling”）等通路，从中度阶段开始到恢复期，持续富集于下调基因中。这表明在病情较重的患者中，出现了显著的适应性免疫抑制。另一方面，一些促炎通路，如白细胞介素-1信号（“IL-1 Signaling”）和白细胞介素-4/13信号（“IL-4/13 Signaling”），则在严重（Severe）和危重（Critical）阶段尤为活跃，反映了炎症状态的持续存在。
3. 3.
   持续的凝血/血小板功能障碍：“血小板脱颗粒（Platelet degranulation）”通路在所有疾病阶段均显示上调，表明血小板活化贯穿整个疾病过程。而“血小板活化、信号和聚集（Platelet activation, signaling and aggregation）”通路以及“纤维蛋白凝块形成的共同通路（Common Pathway of Fibrin Clot Formation）”则在疾病后期（重度到出院期）更为突出。值得注意的是，尽管血小板脱颗粒相关基因表达升高，但临床检测的血小板计数在危重阶段却最低，尤其是在死亡患者中更为明显，提示血小板过度活化消耗可能导致血栓形成风险增加和预后不良。
4. 4.
   代谢紊乱与晚期出现的血红素代谢：在疾病最严重的危重（Critical）阶段，多种代谢通路出现异常，包括“胆固醇生物合成（Cholesterol Biosynthesis）”、“碳水化合物代谢（Metabolism of Carbohydrates）”等，凸显了重症患者严重的代谢失调。相反，“血红素代谢（Heme Metabolism）”相关活动则出现较晚，在重度（Severe）到恢复期（Recovery）阶段才变得显著，这可能与缓解炎症反应和减少氧化应激有关。
5. 5.
   细胞周期相关通路：多个细胞周期相关通路（如“Mitotic Prometaphase”）在整个疾病过程中均显示上调，这可能反映了免疫细胞在应对感染时的增殖反应。

对死亡患者与存活患者在危重阶段的进一步比较发现，死亡患者除了血小板计数显著较低外，其基因表达谱显示出更强的“中性粒细胞脱颗粒（Neutrophil Degranulation）”和更严重的免疫抑制（“Immunoregulatory Interactions”下调），尽管他们的临床评分（如SOFA总分）与存活者相似。这提示基因表达特征可能比常规临床指标更能揭示内在的病理机制和预后。

潜在的老药新用（Drug Repurposing）策略

基于不同阶段的基因表达特征，研究人员利用DSigDB数据库预测了可能具有治疗潜力的已上市药物。

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  疾病早期（轻度/中度）：预测对钙通道阻滞剂（如硝苯地平Nifedipine、维拉帕米Verapamil）和抗组胺药赛庚啶（Cyproheptadine）有反应，这些药物可能通过影响血小板活化相关基因（如CLU, FN1, PF4等）早期干预凝血功能障碍。
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  疾病加重期（轻度至危重）：抗糖尿病药物（如乙酰己酰胺Acetohexamide、吡格列酮Pioglitazone）和糖皮质激素地塞米松（Dexamethasone）的基因签名显著富集。地塞米松已被证实对住院COVID-19患者有效，而抗糖尿病药物可能针对重症阶段出现的代谢紊乱。
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  危重期（Critical）：二甲双胍（Metformin）是排名最高的候选药物。观察性研究已将其使用与较低的COVID-19严重程度相关联。
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  贯穿疾病全程：达沙替尼（Dasatinib），一种用于治疗慢性髓系白血病的酪氨酸激酶抑制剂，是富集程度最高的药物之一。临床前研究表明它可能通过清除病毒诱导的衰老细胞、抑制病毒复制和炎症反应而有益。
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  恢复期（Recovery）：抗癫痫药拉科酰胺（Lacosamide）被独特预测。

这些发现为针对疾病不同阶段进行个性化药物治疗提供了线索。

用于预后判断的疾病阶段基因签名

由于单纯依赖SOFA评分难以准确判断患者处于恶化还是恢复轨迹，研究人员将六个阶段合并为三个更大的疾病期（初始期Initial：轻+中；高峰期Peak：重+危重；恢复期Convalescence：恢复+出院），并开发了能够区分这三个期的基因表达签名。通过LASSO回归，他们最终得到了一个包含49个基因的凝练签名（初始期19个基因，高峰期10个基因，恢复期20个基因）。利用该签名对样本进行分类，准确率分别达到76.7%（初始期）、81.0%（高峰期）和77.7%（恢复期）。重要的是，该签名不仅能区分严重程度，还能反映疾病的时间动态，因为初始期和恢复期患者可能有相似的SOFA评分，但分子特征不同。在一个独立的外部脓毒症患者队列中验证该签名，结果显示，存活者在ICU住院一周后，被归类为高峰期（Peak）的比例显著下降，而非存活者则多数持续被归类为高峰期，证明了该签名在预测疾病轨迹方面的潜力。

疾病阶段与脓毒症内型（Endotype）的关联

研究还探讨了疾病阶段与已知的脓毒症内型（根据特定免疫机制特征将患者分为5型：中性粒细胞抑制型NPS、炎症型INF、干扰素型IFN、适应型ADA、先天宿主防御型IHD）之间的关系。结果发现，疾病阶段与内型分类存在显著关联。预后不良的中性粒细胞抑制型（NPS）内型与重度（Severe）和危重（Critical）阶段正相关；而预后较好的先天宿主防御型（IHD）内型则与出院期（Discharge）和对照组正相关；干扰素型（IFN）内型更多见于疾病早期的轻度（Mild）和中度（Moderate）阶段。这表明，先前观察到的患者异质性部分可由患者处于疾病过程的不同阶段来解释。

结论与意义

这项研究通过纵向转录组分析，清晰地描绘了COVID-19脓毒症患者住院期间分子病理生理学的动态演变图景。研究证实，疾病不同阶段具有独特的基因表达特征，涉及抗病毒反应、免疫调节、凝血、代谢等多个关键生物学过程的时序性失调。这些发现不仅深化了对COVID-19发病机制的理解，也因其与脓毒症的共性而对所有原因的脓毒症研究具有启示意义。研究所预测的阶段特异性治疗药物（如达沙替尼、抗糖尿病药、抗血小板药等）为未来开展老药新用的临床 trials 提供了优先方向。所开发的凝练基因签名有望用于患者风险分层和疾病轨迹监测，为实现“在正确的时间，对正确的患者，进行正确的干预”这一精准医学目标迈出了重要一步。最后，疾病阶段与内型的强关联提示，未来的临床研究设计和治疗策略制定必须充分考虑疾病的时间动力学特性，从而更有效地应对COVID-19乃至脓毒症的高度异质性挑战。