便携式禽流感病毒现场分型系统的开发与应用：实现从实验室到户外的“由内而外”突破

《Scientific Reports》：Development of a portable avian influenza virus characterisation system: bringing the inside-out

为解决高致病性禽流感病毒(HPAI)在偏远或资源有限地区难以实现快速、准确分型的问题，研究人员开发了一套集样本处理、快速测序和生物信息学分析于一体的便携式实验室系统。该系统成功在实验室和野外（包括南极）环境中，对已知亚型的AIV分离株及拭子样本进行了验证，并准确鉴定出HPAI H5N1和H7N6等毒株。该研究为AIV的现场监测和疫情快速响应提供了强有力的技术支撑，显著缩短了从样本采集到结果获取的时间。

　　

在遥远的南极，一只贼鸥的死亡引起了科学家的警觉。它是否感染了正在全球肆虐的高致病性禽流感病毒(HPAI)？如果按照传统的检测流程，科学家需要将样本从南极运回数千公里外的实验室，这个过程可能耗时数周，不仅可能延误疫情控制，样本在运输途中也可能降解或混淆。面对这一挑战，一支研究团队决定“把实验室搬到现场”，他们开发了一套便携式禽流感病毒(AIV)分型系统，旨在实现病毒亚型的快速、准确鉴定，为全球禽流感防控提供新的利器。

这项题为《Development of a portable avian influenza virus characterisation system: bringing the inside-out》的研究，于2025年12月19日在线发表于《Scientific Reports》杂志。研究团队来自新西兰初级产业部动物健康实验室、Dragonfly Data Science以及澳大利亚联邦大学。他们成功构建了一套集成了样本处理、快速测序和自动化生物信息学分析的便携式系统，并首次在南极野外环境中成功鉴定出HPAI H5N1病毒，证明了该系统在挑战性环境下的强大应用潜力。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，他们利用便携式设备（如Bento Lab Pro）进行病毒RNA提取和全基因组扩增(WGA)；其次，采用牛津纳米孔技术(ONT)进行实时测序；最后，开发了名为Flui的自动化生物信息学流程，用于实时、离线地鉴定病毒亚型。研究样本涵盖了新西兰野生鸟类监测计划(NZWBAIS)中收集的已知亚型AIV分离株、新西兰奥塔哥家禽养殖场的HPAI H7N6阳性拭子，以及2024年12月在南极采集的贼鸥和海豹样本。

Evaluation of portable equipment using AIV isolates

研究人员首先在实验室环境中，使用已知亚型的AIV分离株对便携式设备进行了评估。他们使用便携式Bento Lab Pro热循环仪进行全基因组扩增(WGA)，结果显示，所有AIV阳性样本均产生了预期的AIV特异性扩增产物谱带，与实验室标准设备的结果一致。这表明便携式设备能够有效扩增病毒基因组，为后续测序奠定了基础。

Evaluation of the Influenza A RT-qPCR assay on MIC PCR system

为了验证便携式PCR系统的检测灵敏度，研究人员将AIV RNA样本进行系列稀释，并在便携式MIC PCR系统和实验室标准CFX Opus系统上进行甲型流感RT-qPCR检测。结果显示，两种系统在10^-1至10^-5稀释度下均能稳定检测到病毒，检测限相当。此外，对37份野生绿头鸭拭子样本的检测结果显示，两种系统在判断阴阳性方面具有高度一致性（Kappa=0.934）。这表明便携式MIC PCR系统能够可靠地用于AIV的初步筛查。

Evaluation of the RNA extraction kit on the portable system using AIV isolates

为了确定最适合便携式系统的RNA提取试剂盒，研究人员比较了Qiagen和Zymo两种试剂盒在提取AIV分离株RNA方面的表现。结果显示，两种试剂盒均能成功提取RNA并正确鉴定病毒亚型，表明它们均适用于便携式系统。

Evaluation of the RNA extraction kits on the portable system using swabs

然而，当使用来自奥塔哥家禽养殖场的HPAI H7N6阳性拭子样本进行测试时，两种试剂盒的表现出现了差异。Qiagen试剂盒提取的5份样本均被完全鉴定为H7N6，而Zymo试剂盒仅成功鉴定了2份，部分鉴定1份，另有2份未达到质量阈值。Qiagen试剂盒提取样本的HA和NA片段平均测序深度也普遍优于Zymo。因此，研究人员确定Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit是现场AIV分型的首选RNA提取试剂盒。

Evaluation of Flui as an automated real-time influenza subtyping tool

研究人员开发了名为Flui的自动化实时流感分型工具，并将其与标准的手动比对方法进行了比较。结果显示，对于通过质量阈值的测序数据，两种方法产生的亚型结果具有高度一致性。在HA片段鉴定方面，两种方法具有实质性一致（Kappa=0.76）；在NA片段鉴定方面，两种方法完全一致（Kappa=1.0）。这表明Flui能够作为手动方法的有效补充，实现AIV亚型的自动化、实时鉴定。

HA/NA subtype classification of AIV using the portable system

研究人员利用便携式系统对45份来自新西兰各地绿头鸭的拭子样本进行了处理。结果显示，Flui自动化分型与手动比对方法在HA亚型鉴定上具有实质性一致（Kappa=0.77），在NA亚型鉴定上具有一般性一致（Kappa=0.33）。此外，研究人员还通过人工混合H4N6和H11N2样本模拟共感染，Flui成功识别出混合样本中的H11N2/N6信号，证明了其检测共感染的能力。

Portable in-field system deployment in Antarctica and identification of HPAI

最终，研究人员将便携式系统部署到南极，进行了首次野外实地测试。他们从一只疑似死于HPAI的贼鸥身上采集了拭子样本，并在MV Argus号船上进行了现场处理。测序和生物信息学分析结果显示，该样本为H5N1 HPAI病毒，裂解位点分析证实其具有多碱性氨基酸基序，符合HPAI特征。这一结果在样本采集后两天内即获得，而如果采用传统方法将样本运回新西兰实验室，则需要数周时间。

该研究成功开发并验证了一套集成了样本处理、快速测序和自动化生物信息学分析的便携式AIV分型系统。该系统不仅能在实验室环境下准确鉴定多种AIV亚型，更重要的是，它能够在资源有限的野外环境中（如南极）实现快速、准确的病毒分型。通过在南极成功鉴定HPAI H5N1病毒，该研究证明了该系统能够显著缩短从样本采集到结果获取的时间，为禽流感疫情的早期预警和快速响应提供了强有力的技术支撑。未来，该系统有望被进一步优化，用于检测其他具有重要经济意义的病原体，如口蹄疫病毒，从而在更广泛的领域发挥其“移动实验室”的价值。