UMI聚类工具性能基准测试：提升低频变异检测准确性的关键研究

《Scientific Reports》：Benchmarking UMI clustering tools for accurate detection of low-frequency variants from deep sequencing

本研究针对下一代测序（NGS）中低频变异（<1%）检测因高错误率受限的难题，系统评估了八种UMI聚类工具（包括AmpUMI、Calib、CD-HIT等）在模拟、参考和样本数据中的表现。研究发现，Calib在聚类效率、变异检测准确性和计算性能间实现最佳平衡，显著降低假阳性率，为临床癌症诊断、移植排斥监测等场景提供可靠工具。成果发表于《Scientific Reports》，推动UMI算法优化与精准医疗发展。

　　

在精准医疗和生物医学研究飞速发展的今天，下一代测序（NGS）技术已成为探索遗传变异的核心工具。然而，当研究目光投向频率低于1%的低频变异时，NGS技术本身固有的错误率（通常为0.1%-1%）就像一层迷雾，掩盖了真正的生物学信号，使得在癌症早筛、治疗监测、器官移植排斥评估等关键领域对超低频突变的高灵敏度检测面临巨大挑战。为了拨开这层迷雾，科学家们引入了唯一分子标识符（UMI）这一“分子身份证”策略。在扩增前，每个原始DNA分子都会被标记上独特的UMI，使得测序后能够追溯读长（reads）至同一模板分子，通过聚类形成读长家族（read families），并生成一致性序列来区分真实变异与测序错误。理想很丰满，但现实是UMI本身也可能因碰撞、PCR或测序过程产生错误，导致不准确的聚类，从而影响下游变异检测的准确性。尽管已有多种UMI聚类工具被开发出来，但它们基于不同的算法（如基于比对和无需比对的），性能各异，缺乏系统性的评估，这给研究人员在选择合适工具时带来了困惑。

为了解决这一瓶颈问题，并指导未来工具的开发优化，由Dan Pu和Kunxian Shu领导的重庆邮电大学研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的研究成果。他们进行了一项迄今为止最全面的基准测试研究，系统性地评估了八种主流UMI聚类工具——包括AmpUMI、Calib、CD-HIT、Du Novo、Rainbow、Starcode、UMICollapse和UMI-Tools。研究人员构建了一个多维评估框架，利用模拟数据集（涵盖不同变异等位基因频率VAF：10%至0.025%和不同测序深度：1000X至25000X）、参考数据集（N0015，包含338个已知变异）和真实样本数据集（M0253，包含37个约0.5% VAF的已验证变异），从UMI聚类效率、低频变异检测的准确性（灵敏度、精确度、F1分数）、计算效率（运行时间和内存消耗）等多个维度对这些工具进行了深入比较。

为开展研究，团队首先利用UMI-Gen生成了包含预设真实变异的模拟测序数据。对于真实数据，使用了来自NCBI序列读长存档（SRA）的参考数据集N0015和临床样本数据集M0253。所有数据均经过FASTP进行质控和接头修剪，并提取UMI信息。随后，使用八种工具的默认参数分别进行UMI聚类。聚类后，通过统一的流程（如使用Calib的calib_cons模块生成单链共识序列SSCS，再进一步生成双链共识序列DCS）生成共识序列，并使用BWA-MEM2将其比对至参考基因组GRCh37。最后，使用专门为低频变异检测设计的变异调用软件SiNVICT（v1.0）进行变异检测，并以未聚类的原始数据作为基线进行比较。性能评估指标包括灵敏度、精确度、F1分数以及真阳性（TP）、假阳性（FP）数。所有计算均在配置统一的高性能服务器上完成，以确保结果的可比性。

UMI聚类工具的效果

研究发现，不同工具的UMI利用率和生成的读长家族数量存在差异。除了Rainbow外，大多数工具在模拟数据上UMI利用率接近100%。然而，在参考数据集和样本数据集中，读长家族大小的分布显示，包含单条读长的家族（家族大小=1）占主导地位，这些家族因无法用于生成共识序列而导致数据丢失。不同聚类算法对数据丢失程度的影响显著。更重要的是，虽然聚类工具对真阳性变异数量影响不大，但它们能显著降低假阳性变异 calls，凸显了UMI聚类在错误抑制中的关键作用。

UMI聚类工具的性能随VAF和测序深度在模拟数据集中的变化

评估显示，在高VAF（≥1%）时，测序深度对工具性能影响很小。但当VAF降低至0.05%时，所有工具（除AmpUMI外）的灵敏度均出现明显下降，尤其是在低测序深度下，表明检测超低频变异需要更高的测序覆盖度。AmpUMI在模拟数据集上表现不佳，可能与其和UMI-Gen模拟器的兼容性有关。

精确度和F1分数的分析进一步揭示，AmpUMI、CD-HIT和UMICollapse在所有测序深度下均保持较低的精确度和F1分数。而其他工具的精确度和F1分数随着VAF降低，表现出对测序深度的更强依赖性。

UMI聚类工具在参考数据集变异调用中的性能

在参考数据集N0015（染色体1，包含338个已知变异）上的测试表明，与未聚类数据相比，所有UMI聚类工具均能有效降低假阳性 calls。在不同测序错误率设置下（0.01, 0.001, 0.0001），Calib表现出色，能检测到高数量的真实变异同时保持低假阳性水平。而CD-HIT则表现最差，检测到的真实变异最少且假阳性率最高。

UMI聚类工具在样本数据低频变异调用中的性能

在真实样本数据集M0253（VAF约0.5%）的验证中，结果与参考数据集相似。随着测序错误率降低，大多数聚类工具（除CD-HIT和Du Novo外）比未聚类数据能识别出更多真实变异，同时假阳性数更低。在最低错误率（0.0001）下，Calib成功检测到28个已验证变异，且假阳性数最少，再次证明了其在真实应用场景中的准确性和鲁棒性。

计算效率

计算性能评估显示，基于比对的工具（UMI-Tools和UMICollapse）由于增加了比对步骤，其运行时间和内存消耗通常高于无需比对的工具。在小规模模拟数据集上，Calib运行最快且内存消耗最低。在大型数据集（参考和样本数据）上，AmpUMI、Rainbow和Starcode运行时间最短，而Rainbow和Calib的内存效率表现优异。综合考虑运行时间、内存使用和聚类准确性，Calib被认为是计算效率最均衡的工具。

本研究通过全面的基准测试得出明确结论：UMI聚类工具的选择显著影响UMI利用率、读长家族数量和数据丢失程度。除AmpUMI外，所有工具的检测灵敏度均受VAF和测序深度共同影响，检测超低频变异需要高测序深度。所有UMI聚类工具均能有效降低假阳性，证明了UMI共识策略在错误抑制中的普适价值。在计算层面，无需比对的工具通常效率更高。在八种工具中，Calib凭借其基于局部敏感哈希和MinHashing的图聚类算法，在聚类准确性、变异检测性能和计算效率之间取得了最佳平衡，被推荐为低频变异检测工作流程中UMI聚类的稳健且高效的选择。这项研究不仅为生物医学研究人员选择合适工具提供了关键基准，也为未来开发更精准、更快速的UMI聚类算法指明了方向，将有力推动低频变异检测在癌症研究、疾病早诊等精准医疗领域的深入应用。