蛋白酶3通过介导巨噬细胞吞噬中性粒细胞胞外诱捕网促进Presepsin生成的新机制

《Scientific Reports》：Proteinase 3 is involved in presepsin production through neutrophil extracellular trap phagocytosis by macrophages

本研究针对脓毒症生物标志物Presepsin（P-SEP）的产生机制尚不明确的问题，通过开展巨噬细胞吞噬中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的主题研究，首次发现蛋白酶3（PR3）能够降解NETs来源的CD14生成P-SEP。该研究揭示了P-SEP产生的新通路，为开发自身免疫疾病新型诊断标志物奠定了理论基础。

　　

在重症医学领域，Presepsin（P-SEP）作为脓毒症诊断的重要生物标志物早已获得临床认可，然而令人困惑的是，在系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病患者中，即使没有感染迹象，P-SEP水平也会异常升高。这种矛盾现象暗示着P-SSEP的产生机制可能远比我们想象的复杂，背后隐藏着尚未被揭示的免疫学奥秘。

传统观点认为，P-SEP主要是由单核细胞或巨噬细胞在吞噬细菌时，将细胞膜上的CD14内化并通过溶酶体蛋白酶（如组织蛋白酶D）降解而产生的。然而，日本香川県立保健医疗大学的研究团队在前期的研究中发现了一个有趣的现象：巨噬细胞对中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的吞噬作用竟然比单纯吞噬细菌能产生更多的P-SEP。NETs是中性粒细胞在抵抗病原体时释放的网状结构，由DNA和多种抗菌蛋白组成，在脓毒症和自身免疫疾病中都会显著增加。更令人惊讶的是，当研究人员抑制已知的CD14降解酶（如组织蛋白酶D和弹性蛋白酶）时，P-SEP的产生虽然减少但并未完全停止，这强烈提示还有其它"神秘剪刀"在参与CD14的切割过程。

面对这一科学谜题，Akishige Ikegame教授领衔的研究团队将目光投向了蛋白酶3（PR3）——一种主要存在于中性粒细胞和巨噬细胞中的丝氨酸蛋白酶。虽然PR3在炎症反应中的作用已有报道，但它在细胞内处理吞噬物质方面的功能却鲜为人知。研究人员大胆提出假设：是否M1型巨噬细胞在吞噬NETs的过程中，利用其内部的PR3来降解NETs上携带的CD14，从而产生P-SEP？

为了验证这一设想，研究团队进行了一系列精巧的实验设计。他们首先确认了M1型巨噬细胞中确实富含PR3，其含量甚至高于单核细胞和中性粒细胞。同时，他们通过大肠杆菌DH5α和PMA（佛波酯）两种刺激成功诱导了NETs的形成，并证实这些NETs上确实携带大量CD14分子，为后续研究奠定了基础。

当研究人员将M1巨噬细胞与NETs共培养后，通过免疫荧光染色观察到了令人振奋的结果：CD68阳性的M1巨噬细胞确实能够吞噬瓜氨酸化组蛋白H3（Cit-H3）阳性的NETs，并在细胞内产生P-SEP。更重要的是，P-SEP的产生水平与NETs的数量呈现极强的正相关性（r=0.907），这为两者的因果关系提供了有力证据。

为了确认PR3的关键作用，研究团队使用了两种PR3抑制剂（PMSF和elafin）进行处理。结果显示，抑制PR3活性后，尽管巨噬细胞仍然能够吞噬NETs，但P-SEP的产生却显著减少。这一发现直接证明了PR3在P-SEP生成过程中的不可或缺性。

研究人员还通过抑制吞噬作用本身（使用细胞松弛素D或渥曼青霉素）进一步验证了这一通路。当巨噬细胞的吞噬能力被抑制时，即使存在NETs，P-SEP的产生也大幅降低，这表明吞噬过程是P-SEP产生的必要条件。

最为直接的证据来自体外实验：当将重组人CD14（rCD14）与PR3一起孵育时，可以检测到明显的P-SEP产生，而这种效应同样可以被PR3抑制剂所阻断。Western blot结果明确显示，PR3能够将58kDa的CD14降解为13kDa的P-SEP片段。

本研究主要采用了流式细胞术分析细胞内蛋白酶水平、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测NETs比率、免疫荧光染色观察细胞吞噬行为、Western blotting分析蛋白表达、以及体外重组蛋白降解实验等关键技术方法。所有细胞实验均使用来自健康捐赠者的外周血样本。

M1 M细胞含有高水平的PR3

通过流式细胞术分析发现，M1型巨噬细胞中PR3的平均荧光强度（43,517±812.1）显著高于单核细胞（31,520±391.3）和中性粒细胞（30,285±145.3），表明M1巨噬细胞富含这种蛋白酶，为其功能研究奠定了基础。

NET含有高水平的CD14

研究证实，经E.coli DH5α和PMA刺激诱导的NETs区域中，CD14的平均荧光强度分别达到111,568±1,155.4和86,965±655.8，显著高于未处理中性粒细胞（12,167±43.0），说明NETs是CD14的重要来源。

M1 M通过NET吞噬作用经PR3产生P-SEP

免疫荧光染色显示，CD68阳性的M1巨噬细胞吞噬Cit-H3阳性的NETs后，细胞内可检测到P-SEP的产生，且P-SEP水平与NETs比率高度相关（r=0.907），证实了两者间的密切联系。

抑制PR3可减少P-SEP的产生

使用10μM PMSF和0.5μM elafin抑制PR3活性后，P-SEP水平分别降至117.7±9.7 pg/mL和84.2±2.7 pg/mL，显著低于未抑制组（189.3±17.2 pg/mL），证明PR3在P-SEP生成中起关键作用。

抑制NET吞噬作用可抑制M1 M中P-SEP的产生

当使用细胞松弛素D或渥曼青霉素抑制吞噬作用后，P-SEP产量显著降低（分别降至49.6±1.6 pg/mL和72.3±1.8 pg/mL），表明NETs的吞噬是P-SEP产生的必要条件。

PR3介导重组人CD14切割产生P-SEP

体外实验表明，PR3可直接将重组CD14降解产生P-SEP（266.3±16.4 pg/mL），而该过程可被PR3抑制剂完全阻断，为PR3的直接作用提供了最直接的证据。

这项发表在《Scientific Reports》上的研究首次揭示了PR3在P-SEP产生中的关键作用，完善了我们对这一重要生物标志物生成机制的理解。该研究不仅解释了为何在自身免疫性疾病中P-SEP水平会升高（因为这些疾病状态下NETs形成增加），还为开发新的治疗策略提供了潜在靶点。

尽管该研究存在一定的局限性，如主要使用体外实验系统，且M1巨噬细胞来源于外周血单核细胞而非组织定居巨噬细胞，但其所揭示的PR3依赖性P-SEP产生通路无疑为后续研究开辟了新的方向。未来利用PR3基因敲除动物模型或可控NETs形成系统进行在体验证，将进一步巩固这些发现，并推动P-SEP作为生物标志物在更广泛疾病中的应用。

这一机制示意图清晰展示了M1巨噬细胞通过吞噬NETs，并利用细胞内PR3降解CD14产生P-SEP的全过程，为理解脓毒症和自身免疫性疾病中P-SEP水平升高的机制提供了完整的理论框架。