荧光寿命成像与NF-800探针协同增强HER-2阳性食管腺癌荧光引导手术及探针-受体相互作用研究

《Scientific Reports》：Investigating probe-receptor interactions and enhancing fluorescence guided surgery with fluorescence lifetime imaging and NF-800 in HER-2 positive esophageal adenocarcinoma

本研究针对HER-2阳性食管腺癌手术中肿瘤边界识别难题，开发了基于纳米蛋白（Nanofitin）的靶向探针NF-800，结合荧光寿命成像（FLIM）技术，首次在异种移植和原位动物模型中证实FLIM可通过检测探针-受体结合后的荧光寿命变化（0.77±0.01 ns vs 0.56±0.02 ns）特异性区分肿瘤组织，肿瘤背景比（TBR）提升至9.72±3.42，为精准手术导航提供新策略。

　　

食管癌作为全球第八大癌症死因，每年导致约57.5万例死亡，其中食管腺癌（Esophageal Adenocarcinoma）的HER-2（Human Epidermal Growth Factor Receptor 2）阳性率高达17-32%。手术切除是早期患者的唯一根治手段，但术后生存率仅15-25%，其核心难点在于术中难以精准区分肿瘤浸润边界与正常组织。传统荧光引导手术（Fluorescence Guided Surgery, FGS）虽能提升肿瘤可视化程度，但常因靶向探针的非特异性蓄积（如单克隆抗体尺寸过大导致血液滞留时间长）造成背景信号干扰，制约手术精度。

近年来，源于超嗜热古菌Sac7d蛋白的纳米蛋白（Nanofitin）支架因其7 kDa小分子量、高稳定性及可编程靶向性崭露头角。本研究团队此前已成功构建靶向HER-2的纳米蛋白-近红外染料IRDye800CW偶联物（NF-800），但其在复杂手术环境中的特异性识别能力仍需验证。与此同时，荧光寿命成像显微镜（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM）技术通过检测荧光分子从激发态返回基态的时间特征（荧光寿命），可有效规避浓度、内化程度等变量干扰，直接反映探针与微环境相互作用，为提升肿瘤对比度提供新思路。

为突破现有技术瓶颈，来自意大利Bracco成像研究中心的研究团队在《Scientific Reports》发表最新研究，首次将FLIM技术与NF-800探针相结合，在HER-2阳性食管腺癌动物模型中系统评估了探针-受体相互作用机制及手术导航潜力。研究通过构建异种移植与原位肿瘤模型，发现NF-800在肿瘤组织中荧光寿命显著延长（0.81±0.06 ns），且与HER-2表达量呈强相关（Pearson r=0.75），并通过溶剂极性、黏度实验揭示探针结合位点特性（Tz-800依赖疏水口袋，NF-800结合亲水位点）。该工作为小分子靶向探针的临床转化提供了分子环境响应性新证据。

关键技术方法方面，研究采用OE-19人食管腺癌细胞系构建异种移植（皮下注射5×10⁶细胞）及原位肿瘤模型（手术植入4 mm³组织块），通过7T MRI监测肿瘤进展；利用自主搭建的时间门控宽场荧光显微镜（激发波长747 nm，发射滤片776 nm）采集荧光寿命数据，采用尾部拟合算法分析寿命值；通过Western Blot量化肿瘤HER-2表达，并与FLIM参数映射（FLIMFit软件生成）进行像素级相关性分析；体外实验通过溶剂极性梯度（甲醇至氯仿）和甘油黏度系列溶液探究寿命决定因素。

In vivo model characterization

研究首先建立OE-19细胞衍生的异种移植模型（肿瘤体积达400 mm³）和原位移植模型（模拟临床浸润特征）。免疫荧光与Western Blot证实肿瘤组织HER-2特异性表达于上皮细胞，且存在个体间异质性（图S1-S2）。原位模型T2加权MRI显示肿瘤沿食管-胃接合部侵袭性生长（图1），成功复现临床病理特征。

In vivo experiments

活体实验显示NF-800在注射后4-6小时于肿瘤特异性蓄积（图2A-B）。荧光寿命分析揭示肿瘤组织寿命值（0.77±0.01 ns）显著高于肾脏（0.56±0.02 ns）和肝脏（0.51±0.01 ns）（p<0.0001），且与PBS中游离探针寿命（0.44±0.03 ns）差异显著，提示寿命延长源于HER-2特异性结合（图2C）。原位模型中，NF-800的肿瘤背景比（TBR=9.72±3.42）较阳性对照Trastuzumab-IRDye800CW（Tz-800）提升近一倍（图S3），且参数映射可清晰区分肿瘤浸润区域（寿命0.7-1 ns）与正常胃组织（约0.6 ns）（图4）。

FLIM and WB Correlation Analysis

通过关联FLIM参数映射与Western Blot数据，发现寿命值0.71-0.72 ns区间的像素数量与肿瘤HER-2浓度呈正相关（r=0.75），证实荧光寿命可作为靶点密度的定量指标（图S4）。

Fluorescence Lifetime in vitro measurements

体外环境筛查显示IRDye800CW在血清中寿命延长（0.48→0.75 ns），但偶联NF-800/Tz-800后此效应减弱，提示探针空间位阻抑制染料-白蛋白结合（表1）。溶剂极性实验表明NF-800结合位点极性近似乙醇（极性值0.29），而Tz-800更契合疏水环境（表2）；甘油黏度实验进一步证实Tz-800寿命变化主要受运动限制驱动，NF-800则同时受极性与黏度调控（表3）。

In vitro cell measurements

细胞实验显示NF-800在OE-19细胞中摄入量（3.68 pmol）高于Tz-800（3 pmol），且结合状态下寿命延长（0.71±0.01 ns）。低温结合实验中Tz-800寿命升至0.94±0.08 ns，证实其HER-2结合特异性（图5）。

研究结论指出，FLIM技术通过解析NF-800与HER-2结合后的荧光衰减动力学，实现了对食管腺癌的精准边界识别。其核心优势在于：一是寿命信号对探针浓度不敏感，可有效区分特异性结合与非特异性蓄积；二是NF-800小分子量（7 kDa）赋予其高组织穿透性，较传统抗体探针（如150 kDa的Tz-800）更早达到成像窗口；三是通过极性/黏度双重调控机制，荧光寿命可反映探针在细胞内的微环境状态。尽管当前临床FLIM设备存在成本高、分辨率受限等挑战，但结合人工智能的实时分析算法（如CAD）有望推动该技术向术中导航转化。本研究不仅为HER-2阳性胃肠道肿瘤的精准切除提供新工具，更开创了通过荧光寿命解析靶向探针作用机制的新范式，为下一代智能手术系统开发奠定基础。