SPLiCR-seq技术平台：通过CRISPR筛选揭示内质网应激下IRE1α-XBP1信号通路新调控因子及其在CAR-T细胞治疗中的应用

《Nature Communications》：SPLiCR-seq: A CRISPR-Based Screening Platform for RNA splicing Identifies Novel Regulators of IRE1α-XBP1 Signaling Under ER Stress

本研究针对系统性研究RNA剪接调控的难题，开发了SPLiCR-seq高通量CRISPR筛选平台，应用于内质网应激下XBP1剪接调控机制研究。发现GADD34（PPP1R15A）作为IRE1α-XBP1信号新型调控因子，其药理抑制可改善CAR-T细胞功能。这项工作为RNA剪接研究提供了强大工具，并为肿瘤免疫治疗提供了新策略。

　　

细胞内的蛋白质质量控制是维持生命活动的基础，当内质网中未折叠或错误折叠蛋白质累积时，会引发内质网应激（Endoplasmic reticulum stress）并激活未折叠蛋白反应（Unfolded protein response, UPR）。IRE1α-XBP1信号通路是UPR中最保守的一条分支，其核心环节是IRE1α介导的XBP1 mRNA的非典型剪接，产生有活性的转录因子XBP1s，进而调控一系列应激相关基因的表达。尽管该通路的重要性已被广泛认知，但由于缺乏高效、系统的研究工具，科学家们对RNA剪接在这一关键应激响应过程中的精细调控网络仍知之甚少。传统的基于荧光报告基因的剪接分析方法通量低、难以实现全基因组规模的筛选，限制了新调控因子的发现。为了突破这一瓶颈，研究人员迫切需要开发一种能够直接、高通量地检测遗传扰动下RNA剪接结果的新技术平台。

在此背景下，发表在《Nature Communications》上的这项研究开发了一种名为SPLiCR-seq（Splicing regulator identification through CRISPR screening）的革命性CRISPR筛选平台。该技术巧妙地将CRISPR-Cas9基因编辑系统与高通量测序相结合，能够直接、精准地测量混合遗传扰动群体中特定RNA剪接事件的结果，从而实现对RNA剪接调控因子的大规模、系统性鉴定。研究人员利用这一强大工具，深入探究了内质网应激下XBP1剪接的调控网络。

为开展研究，作者主要应用了以下关键技术：SPLiCR-seq高通量CRISPR筛选平台（用于在全基因组和靶向范围内鉴定RNA剪接调控因子）、免疫共沉淀和蛋白质印迹（用于验证蛋白质相互作用）、体外CAR-T细胞培养模型（用于评估GADD34抑制的功能效应）、以及肿瘤细胞杀伤实验（用于测试CAR-T细胞的抗肿瘤活性）。

SPLiCR-seq平台的构建与验证

研究人员首先设计并验证了SPLiCR-seq平台。该平台的核心在于将引导RNA（sgRNA）序列与包含特定剪接事件的报告序列关联起来，通过高通量测序同时读取sgRNA的身份和对应的剪接产物比例。研究团队通过测试已知的剪接调控因子，证实了SPLiCR-seq能够准确、灵敏地检测出由CRISPR敲除引起的剪接变化，其性能优于传统的荧光激活细胞分选（FACS）方法，证明了该平台的可靠性。

在不同细胞背景下筛选XBP1剪接调控因子

应用SPLiCR-seq，研究团队首先进行了靶向筛选，重点关注了与RNA代谢和UPR相关的基因集。随后，他们扩展至全基因组筛选，并在多种细胞系（包括HEK293T和HeLa细胞）中进行，以探究细胞类型特异性的调控机制。筛选结果揭示了一批能够显著影响XBP1剪接的候选基因，其中包括已知的UPR相关因子，也发现了许多前所未有的新型调控因子，凸显了XBP1剪接调控网络的复杂性。

GADD34是IRE1α-XBP1信号通路的新型直接调控因子

在众多候选因子中，PPP1R15A（编码GADD34蛋白）脱颖而出。GADD34此前已知的功能是作为应激诱导蛋白，通过与蛋白磷酸酶1（PP1）复合物促进eIF2α的去磷酸化，从而在应激后期恢复全局蛋白质翻译。然而，本研究发现，在內质网应激下，敲低或敲除GADD34会特异性增强IRE1α的活性和XBP1的剪接，而不影响UPR的其他分支（如PERK或ATF6通路）。进一步的机制研究表明，GADD34能够与IRE1α发生直接的蛋白质-蛋白质相互作用，这种相互作用不依赖于其通过PP1介导的eIF2α去磷酸化功能。这意味着GADD34是IRE1α-XBP1信号通路的一个全新的、直接的正向调控因子，其功能独立于其经典角色。

药理抑制GADD34可改善CAR-T细胞功能

鉴于IRE1α-XBP1信号通路在T细胞功能和衰竭中的重要作用，研究人员探讨了靶向GADD34的治疗潜力。他们使用小分子化合物Sephin1（一种GADD34/PP1相互作用的抑制剂）处理CAR-T细胞。在体外内质网应激模型中，Sephin1处理有效抑制了XBP1的剪接，并显著减轻了CAR-T细胞的衰竭表型。最为重要的是，这种处理增强了CAR-T细胞在多种肿瘤模型中的杀伤能力，表明通过药理干预GADD34来调节IRE1α-XBP1通路，是改善CAR-T细胞免疫治疗效力的一个有前景的策略。

本研究成功开发了SPLiCR-seq这一强大的功能性基因组学平台，为系统性研究RNA剪接调控提供了通用工具。通过应用该平台，研究不仅揭示了XBP1剪接在不同细胞环境下的调控网络，更重要的是鉴定出GADD34是IRE1α-XBP1信号通路的一个前所未有的直接调控因子，拓展了我们对GADD34生物学功能的认识。最终的功能性实验证明，药理抑制GADD34能够有效改善CAR-T细胞的抗肿瘤活性，这为克服当前CAR-T细胞治疗中存在的衰竭难题提供了新的理论依据和潜在的干预靶点。因此，这项工作不仅在方法学上具有重要创新，也为理解和靶向UPR相关疾病（如癌症、免疫疾病）开辟了新的方向。