MIDAS：用于宿主-病原体整合分析的快速多重分子谱分析新技术

《Nature Communications》：MIDAS: rapid, multiplexed molecular profiling for integrated host–pathogen analysis

为解决脓毒症诊断中病原体与宿主反应分析相互割裂、耗时长的难题，研究人员开发了MIDAS平台。该研究通过整合形状编码水凝胶颗粒、无透镜衍射成像与深度学习分析，实现了细菌RNA与炎症蛋白的同步快速（<4小时）定量检测，在猪模型验证中与金标准方法高度一致。这项技术为发展床旁宿主-病原体整合分析工具奠定了基础。

　　

当患者出现感染迹象时，医生往往面临一个艰难抉择：是立即使用广谱抗生素，还是等待确切的病原体检测结果？在脓毒症（sepsis）这种由感染引发的危及生命的器官功能障碍面前，这个抉择尤为关键。脓毒症每年影响超过170万美国人，导致约27万人死亡，医疗成本高达240亿美元。它是住院患者死亡的主要原因，而幸存者常常面临严重的长期健康问题。

目前的诊断方法存在明显不足。临床上主要依赖非特异性临床标准（如心率、血压、呼吸频率）来识别潜在脓毒症患者，导致高假阳性率。在没有快速特异性检测的情况下，疑似脓毒症患者经常接受不必要的过量抗生素治疗，这加剧了抗生素耐药性的发展。

更根本的问题在于，当前脓毒症诊断技术的发展沿着两条平行且不交叉的轨道进行：一条试图识别病原体，另一条寻找宿主对感染反应的生物标志物。现有方法未能捕捉到宿主与病原体之间动态的双向信号传递，而这对于全面理解脓毒症至关重要。

标准病原体检测方法（培养法）速度慢（长达数天），难以在床旁（Point-of-Care, POC）应用，且识别某些物种的能力有限。而宿主反应监测通常依赖一维生物标志物测试（如乳酸、降钙素原、C反应蛋白等），不能充分捕捉脓毒症的异质性。尽管基因组学/转录组学等先进技术已出现，但它们受到周转速度慢（数小时甚至数天）、成本高、复杂度高、多重检测能力有限以及缺乏灵活性以适应不同疾病和条件的其他生物标志物等因素的制约。最重要的是，目前尚无现有的临床可及系统能够在单一系统中同时测量多种不同的实体。

为了填补上述空白，研究人员开发了一种通用策略——MIDAS（Multiplexed Intelligent Diffraction Analysis System，多重智能衍射分析系统），用于在单一系统中整合分析多种宿主蛋白和细菌基因。MIDAS协同整合了（i）用于广视场衍射图像采集的无透镜衍射光学系统，（ii）用于高多重检测的形状编码水凝胶传感器阵列，以及（iii）用于快速、自动衍射图像分析的深度学习（Deep Learning, DL）算法，所有这些都针对繁忙临床和/或资源有限环境中的便携性、简单性和POC使用进行了优化。

本研究将MIDAS作为一个概念验证平台提出，该平台可以并行量化蛋白质和核酸标志物。据研究人员所知，这是首个能够同时分析病原体和宿主反应的系统演示。

研究人员主要采用了以下几项关键技术方法：利用定制的微流控停流光刻（Stop-Flow Lithography, SFL）技术合成形状编码的聚乙二醇二丙烯酸酯（Poly(ethylene glycol)diacrylate, PEGDA）水凝胶微粒；构建了紧凑、低成本的无透镜衍射成像传感系统（MIDAS设备）；开发了基于深度学习的三阶段工作流程（颗粒识别、编码分类、颜色读出）用于自动分析原始衍射图；建立了类似于酶联免疫吸附测定（ELISA）的比色标记方案用于蛋白质分析（MIDAS-protein assay）和基于夹心杂交技术的核酸分析方案（MIDAS-nucleic acid assay），靶向细菌16S核糖体RNA（16S ribosomal RNA, 16S rRNA）和炎症细胞因子（如IL-1β, IL-6等）；并使用来自明确感染病因的猪脓毒症模型的血液和血浆样本进行平台验证，与培养、定量聚合酶链式反应（quantitative PCR, qPCR）、ELISA/Luminex等参考标准方法进行比对。

整体检测流程与标志物选择

MIDAS分析的整体工作流程始于采集人体生物流体样本（如血液、尿液、支气管肺泡灌洗液），并将其分流用于蛋白质和RNA标志物的平行多重检测。样本随后通过ELISA样的比色标记方案（用于蛋白质分析）和杂交技术（用于RNA分析）进行处理，使用带有独特“齿轮”编码的形状编码水凝胶颗粒混合物来检测多个目标分子。染色后的颗粒被固定在玻璃基底的指定区域，并由MIDAS设备成像。随后应用定制开发的DL分析算法进行颗粒检测、分类和标志物表达读数。MIDAS诊断程序在3-4小时内完成蛋白质和RNA分析，显著快于标准培养（2-3天）。

为识别或排除脓毒症，研究使用了两组标志物用于宿主-病原体界面的整合分析：（i）用于病原体检测和表型分析的细菌核酸，以及（ii）用于评估宿主反应的炎症血浆蛋白。选择细菌作为模型病原体，因为细菌感染是脓毒症最常见的原因。目标标志物包括来自阳性培养病例中前五种细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌）的16S rRNA基因，以及用于量化样本中总细菌载量的通用靶标（16S rRNA基因的高度保守区域）；炎症血浆蛋白包括IL-1β、IL-3、IL-6、IL-10和TNF-α。

颗粒设计与合成用于多重检测

为了制造形状编码颗粒，研究人员使用定制的微流控停流光刻系统生成不同形状和大小的水凝胶微粒阵列。该方法允许高通量（约10个颗粒/秒）、高分辨率（约2μm）、高灵活性（形状/尺寸）和低成本的制造。在初步测试中，使用简单的齿轮编码方案生成颗粒，在本研究中设计了具有八个齿的齿轮颗粒，总共有16个独特编码，从中选择了五个特定编码用于后续的蛋白质和RNA分析。

用于大视场分析的MIDAS传感器

MIDAS传感硬件被设计成一个紧凑、经济高效的系统，用于形状编码水凝胶颗粒的广视场衍射图像采集。该设备由发光二极管（Light-Emitting Diode, LED）、孔径和互补金属氧化物半导体（Complementary Metal-Oxide-Semiconductor, CMOS）板式相机组成。入射光与颗粒散射光之间的干涉图案由位于样品下方的相机直接记录。该传感系统紧凑，成本效益高，无需中间光学组件（如透镜、滤光片）。

与可比的可及性和成本的明场系统（传统明场显微镜、数码手持显微镜、带夹式镜头的智能手机）相比，MIDAS提供了约30 mm2的视场，可比或略大于比较系统，同时为特征级分析提供了足够的分辨率。在实践中，这使得单次采集可检测约5000个颗粒，而使用明场显微镜约为820个颗粒。研究还测试了衍射图案是否可用于提取颗粒的颜色信息。MIDAS颜色强度分布与显微镜测量结果高度相关（Pearson相关系数r = 0.98），证实基于衍射的传感保持了染色颗粒的颜色信息。

用于快速准确颗粒分析的深度学习算法

传统的衍射图像分析依赖于计算密集的重建，通常需要配备图形处理器（GPU）的服务器或基于云的处理。这些要求限制了在床旁或资源有限环境中的实用性。为了解决这些限制，研究人员开发了一个基于深度学习的工作流程，直接解读原始衍射图，无需图像重建。经过集中训练后，所得模型可以部署在标准计算机（甚至低功耗微控制器）上，实现快速、完全离线的分析。

设计了一个三阶段深度学习工作流程来自动定位和分类原始衍射图像中的编码颗粒：（1）颗粒识别，（2）编码分类，和（3）颜色读出。在第一阶段，使用斑点检测算法识别候选颗粒区域，然后使用卷积神经网络（Convolutional Neural Network, CNN）区分颗粒与背景伪影。该模型在标注的衍射图像数据集上训练，实现了约100%的验证准确度和约99.2%的测试准确度。第二阶段使用单独训练的CNN对每个检测到的颗粒相关的编码进行分类，最佳验证准确度约100%，测试准确度约94.1%。在最后的颜色读出阶段，算法计算检测到的颗粒周围小区域内的平均像素强度，然后参考校准曲线确定相应目标生物标志物的表达水平。

MIDAS检测在蛋白质分析中的表征

首先使用一组已知且有前景的脓毒症炎症生物标志物对MIDAS检测进行了多重蛋白质分析的表征。MIDAS-蛋白质检测的比色标记方案包括：（i）将颗粒与捕获抗体偶联，（ii）使用抗体偶联颗粒混合物从血浆中提取目标，（iii）用检测元件标记颗粒，以及（iv）通过碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AP）和BCIP/NBT底物进行比色信号放大。

研究人员首先将MIDAS与商业ELISA试剂盒在检测人血浆中IL-3方面进行了基准测试。MIDAS的灵敏度提高了28倍，检测限（Limit of Detection, LOD）为4.09 pg/mL，而ELISA为115 pg/mL。随后将分析扩展到五种细胞因子，观察到MIDAS在所有目标上始终比ELISA实现更高的灵敏度（即更低的LOD），同时保持兼容或更宽的动态范围。

在多重检测方面，MIDAS检测在五个目标之间显示出优异的灵敏度和特异性，目标之间的交叉反应性可忽略不计。该检测还显示出高准确性，所有目标的回收率均在商业可接受的范围内（70-130%）。

MIDAS检测在核酸分析中的表征

接下来评估了MIDAS在细菌核酸多重检测方面的表现。MIDAS-核酸检测使用夹心杂交技术，其中每个水凝胶颗粒携带一个捕获寡核苷酸，选择性结合从细菌RNA生成的目标序列。杂交后，引入带有生物素的第二个寡核苷酸来标记同一扩增产物的相反区域，通过链霉亲和素-碱性磷酸酶（Streptavidin-Alkaline Phosphatase, StAv-AP）和BCIP/NBT显色实现酶促比色读数。

为了确定MIDAS-核酸检测的分析灵敏度，首先检查了大肠杆菌作为代表性模型生物。对合成寡核苷酸和细菌RNA生成的cDNA的连续稀释进行分析，得出的LOD约为3.0 pM [DNA]，相当于50μL样品中约150 amol的目标。由于临床相关的菌血症通常涉及极低的微生物负荷，随后将规定数量的大肠杆菌掺入全血。经过样品处理和扩增后，MIDAS可可靠地检测到血液中低至约2细菌/mL的数量。PCR循环数影响动态范围：约35个循环产生最宽的定量窗口，而额外的循环以更窄的线性范围为代价提高了灵敏度。

然后将检测扩展到五种与脓毒症相关的临床相关病原体。使用物种特异性探针组，MIDAS实现的LOD范围在1.41至35.8 pM之间。该平台在几个数量级的细菌负荷范围内产生定量信号，这部分得益于16S rRNA固有的高丰度（每个细菌10³-10⁵拷贝），支持稳健的扩增和灵敏的检测。

为了支持广泛的病原体筛查，还实施了一种针对多个物种16S rRNA基因保守区域的“通用”检测策略。这种配置在不同物种间产生一致的信号，并准确反映了含有每种生物约100菌落形成单位（Colony-Forming Unit, CFU）的混合样品中的总细菌负荷，证明了其作为病原体存在的一线筛查工具的实用性。

最后，应用MIDAS进行物种水平区分，使用针对16S序列高变区的探针。多重检测显示每个物种具有明显、非重叠的信号，脱靶结合最小。与qPCR相比，MIDAS表现出改进的特异性，这可能源于其需要捕获和检测探针同时识别。

MIDAS验证

研究人员使用来自已建立的猪脓毒症模型的临床相关样本评估了MIDAS检测的临床效用。该模型在早期诊断验证方面优于人体研究，提供了关于感染病因的明确基础事实，允许高频连续采样（包括脓毒症前基线测量）用于内部比较，允许收集更大血容量以用于与当前标准检测（如血培养、qPCR、ELISA）并行测试，并避免了人体队列中常见的混杂变量。

为了确认猪感染模型反映的是脓毒症而非孤立性菌血症，使用Sepsis-3定义对动物进行了评估。操作上，Sepsis-3将脓毒症定义为由于感染导致序贯器官衰竭评估（Sequential Organ Failure Assessment, SOFA）评分增加≥2分。使用来自猪的数据和SOFA评分定义，确定在基线（感染前）和实验终止（范围6-24小时）之间的多个时间点的器官特异性SOFA评分。在大肠杆菌接种后，所有动物在至少一个器官系统SOFA评分中显示增加≥2分，从而满足Sepsis-3标准。这些发现支持该猪模型再现了当前定义的脓毒症临床综合征。

在将大肠杆菌接种物注射到肾实质后，在基线和感染后最多24小时的多个时间点从猪收集全血和血浆样本。样品储存于-80°C直至检测，此时使用当前参考标准诊断方法（培养、qPCR、ELISA/Luminex）以及MIDAS检测进行分析，MIDAS在4小时内完成了细菌RNA和宿主蛋白分析。对于猪样本，通过替换猪特异性抗体并相应优化检测条件来调整MIDAS蛋白检测。

MIDAS在检测细菌存在和物种方面与培养和qPCR高度一致，在32个样本中准确检测出30个（93.8%）。两个不一致的病例细菌载量极低（培养结果为1 CFU），未检测到可能反映了采样限制。同时，MIDAS的细胞因子测量与参考方法（Luminex/ELISA）强烈相关，Pearson相关系数（r）=0.87。

研究结论与意义

本研究开发的MIDAS平台为解决脓毒症诊断中的一个关键空白提供了方案：病原体与宿主免疫反应的同时检测——这是当前诊断策略中一个重要但常被忽视的方面。与通常专注于单一诊断轴并常依赖中心实验室基础设施的现有技术不同，MIDAS是首个能够在单一平台内实现病原体和宿主生物标志物分子多重检测的系统，为未来脓毒症诊断和研究应用的发展提供了有希望的潜力。

除了其临床相关性，MIDAS代表了一项重要的技术进步。它协同整合了形状编码水凝胶微粒、无透镜数字传感和基于深度学习的解码。与传统的多重检测平台相比，形状编码颗粒具有明显的优势。MIDAS通过使用定制深度学习模型直接从原始衍射图像实现稳健的、方向不变的解码，克服了传统解码方法的挑战。由此产生的平台紧凑、低成本，非常适合未来的床旁部署。

MIDAS在检测灵敏度、多重检测能力、检测时间、成本方面为传统诊断方法提供了互补能力，并且可以轻松应用于床旁场景。在这项概念验证研究中，MIDAS-蛋白质检测展示了5重蛋白质检测能力，对IL-3的检测灵敏度（LOD）为4.09 pg/mL，比标准ELISA的115 pg/mL LOD提高了25倍以上。类似地，MIDAS-核酸检测在对一组5种细菌的检测和表型分析中显示出高特异性和灵敏度，使用35个PCR循环对细菌病原体的LOD低至约2 pM，相当于生物流体样品中约3-4 CFU/mL。这种灵敏度水平至关重要，因为脓毒症患者血液中的微生物负荷通常较低，在1到100 CFU/mL之间。

当前工作旨在证明MIDAS的整体概念。因此，广泛的临床测试超出了这项开发研究的范围。然而，第一个原型机的数据提出了一些需要改进的领域，包括实现真正的样本进-结果出设备的自动化样品制备和流体处理、提高多重检测能力、进一步增加通量和分辨率、探索额外的信号放大策略、扩展至非细菌病原体和抗菌素耐药性分析，以及使用新鲜生物样本和最终患者样本进行更大规模的前瞻性验证。

总之，MIDAS平台为病原体和宿主生物标志物的同步分析提供了一种模块化、多重化的方法。通过解决当前诊断方法的关键限制——特别是周转时间慢、成本高、多重检测能力有限以及处理各种生物实体的灵活性低——MIDAS可以为改进脓毒症诊断的未来发展提供一个有希望的基础。其通用和模块化的设计将允许超越本研究中选择的初始传感器元件和标志物面板进行扩展。经过进一步验证和开发，这种多功能方法可能在多个领域产生广泛影响。