定向进化TNA聚合酶揭示保真度与催化活性独立演化的结构基础

《Nature Communications》：Directed evolution of a TNA polymerase identifies independent paths to fidelity and catalysis

本文报道了通过定向进化技术优化TNA聚合酶（TNAP）的研究，解决了人工遗传聚合物合成效率低下的难题。研究人员解析了关键进化中间体的晶体结构，发现保真度与催化活性的提升遵循独立路径，分别由底物识别与活性中心几何构象优化驱动。该工作为理解酶功能创新提供了新机制，对合成生物学工具开发具有重要意义。

　　

在合成生物学领域，设计能够合成人工遗传聚合物（XNA）的酶是拓展生命分子多样性的关键挑战。苏糖核酸（TNA）作为一种潜在的前生命遗传物质，其聚合物具有独特的生物稳定性和折叠能力，但在自然界中缺乏专性合成酶类。传统DNA聚合酶对TNA三磷酸（tNTP）底物的催化效率极低，且难以同时实现高保真度与高活性。理解酶如何通过进化获得新功能，不仅对人工生命系统构建有应用价值，更能揭示蛋白质功能创新的基本规律。

加州大学欧文分校Chaput团队在《Nature Communications》发表研究，通过追踪定向进化实验中TNA聚合酶（TNAP）10-92的演化路径，结合结构生物学与生物化学分析，揭示了保真度与催化活性独立进化的分子机制。该研究发现早期变异体通过结构重组率先提升底物识别准确性，而催化效率的优化则需后期活性中心的精细调整，颠覆了传统认知中二者协同进化的观点。

研究采用定向进化、X射线晶体学、酶动力学分析、底物特异性检测和热稳定性评估等关键技术。团队通过液滴光学聚合酶分选（DrOPS）技术筛选突变文库，获得关键进化中间体（5-270、7-47、8-64和10-92）。利用分子置换法解析二进制和闭合三元复合物晶体结构（分辨率2.17-2.56 ?），并通过合成2'-脱氧-α-L-苏呋喃糖基胸苷-3'-三磷酸（dtTTP）类似物捕获反应中间态。酶动力学采用单周转条件测定催化速率，保真度通过水凝胶粒子逆转录测序评估。

结果部分显示，生化分析发现保真度在进化早期（5-270）显著提升，而催化活性改善滞后于后期（10-92）。所有变体在90°C处理6小时后仍保持活性，证明定向进化未必牺牲蛋白稳定性。底物特异性分析表明，10-92首次实现TNA合成活性反超DNA合成13倍。结构生物学证据揭示，二进制复合物中所有TNAP变体均出现意外的闭合构象，由指状结构域（α14-α15螺旋移动22°）与核酸外切酶域间静电/疏水网络稳定。该预组织状态首次出现于5-270，可能通过平衡构象动力学促进催化。

三元复合物结构追踪显示，活性中心体积经历扩张（Kod-RI较野生型增大250%）后收缩（10-92较野生型小10%），以适应TNA四碳糖的较小尺寸。催化三联体（D405/D541/D543）通过逐步重排逼近天然Kod DNAP构型，引物2'-羟基与tATP α-磷酸距离从5-270的5.8-6.7 ?优化至10-92的3.9 ?（天然酶为3.7 ?）。新生沃森-克里克碱基对几何参数（开口角、螺旋角等）在5-270已接近天然状态，而反应中心几何优化持续至最终变体。

突变景观分析表明，10-92的51个突变中多数远离活性中心（>20 ?），凸显长程相互作用的重要性。回复突变实验鉴定出D615G、A741P、T548P、S493G和P550H等关键催化优化突变，这些甘氨酸/脯氨酸替换通过调节局部刚性平衡活性中心构象。早期同源重组引入的35个突变（如381L插入、G602D、K672R）共同驱动全局结构重组，为保真度提升奠定基础。

该研究证实酶功能创新可通过模块化路径实现：底物识别精度（保真度）与过渡态稳定（催化效率）受独立进化压力驱动。预组织闭合构象的发现为理性设计构象动态酶提供新范式。研究还挑战了功能增益必以稳定性损失为代价的经典认知，证明严格筛选可兼顾高效性与结构稳健性。这些发现对开发定制化合成生物学工具及完善蛋白质进化理论具有深远意义。