ADP-核糖基环化酶赋能外泌体化学工程：一种用于精准生物偶联的通用平台

《Nature Communications》：A versatile platform for chemical engineering of exosomes empowered by ADP-ribosyl cyclases

现有外泌体化学修饰方法存在非特异性、异质性强等问题。本研究开发了一种基于ADP-核糖基环化酶(CD38)及其共价抑制剂(2'-Cl-araNAD+)的位点特异性功能化平台(ARC Exos)。该平台成功实现了外泌体表面小分子配体(FA)、细胞毒性载荷(MMAF)及骨靶向剂(BP)的精准偶联，并在体外和体内验证了其靶向递送和抗肿瘤活性，为外泌体的化学工程提供了通用策略。

　　

细胞分泌的外泌体(Exosomes)作为一种天然的纳米级囊泡，因其在细胞间通讯中的重要作用以及高生物相容性，已成为生物医学研究中的明星材料。科学家们已经能够通过基因工程手段，在外泌体表面表达各种功能蛋白，赋予其新的功能。然而，如何将非蛋白质类的小分子生物活性物质（如荧光探针、靶向配体、细胞毒性药物等）精准地“安装”到外泌体上，却一直是个难题。传统的化学偶联方法通常依赖于与表面赖氨酸或半胱氨酸残基的非特异性反应，或者通过脂质插入随机嵌入膜中。这些方法不仅会导致外泌体被异质性修饰，还可能破坏外泌体蛋白的结构和功能，限制了其应用潜力。

为了解决这一难题，来自南加州大学(University of Southern California)的研究团队在《自然·通讯》(Nature Communications)上发表了一项突破性研究。他们开发了一种名为“ADP-核糖基环化酶赋能外泌体(ARC Exos)”的通用平台，能够像“分子订书机”一样，将各种功能小分子精准、特异地“钉”在外泌体表面。这项技术为外泌体的化学工程开辟了新的道路，有望推动外泌体在疾病诊断和治疗中的更广泛应用。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，他们通过分子克隆技术构建了CD38-CD9融合蛋白表达载体，并在Expi293F细胞中表达，通过差速离心和超速离心法纯化获得表面展示有高活性CD38酶的外泌体。其次，他们通过化学合成方法制备了多种功能化的2'-Cl-araNAD⁺共价抑制剂前体。然后，利用酶促反应和点击化学(Click Chemistry)实现了外泌体与荧光染料(Alexa 488)、叶酸(FA)、细胞毒性药物(MMAF)以及双膦酸盐(BP)的位点特异性偶联。在体外功能验证中，他们采用了酶联免疫吸附试验(ELISA)、流式细胞术、共聚焦显微镜和细胞毒性(MTT)实验。在体内研究中，他们建立了人源化免疫重建的NSG小鼠模型，通过尾静脉注射构建了乳腺癌骨转移模型，并利用活体生物发光成像(IVIS)、显微计算机断层扫描(Micro-CT)和组织病理学分析等手段评估了外泌体的体内分布、抗肿瘤疗效及安全性。

设计表面锚定催化活性CD38的外泌体

研究人员首先设计了一种策略，将CD38的酶活性结构域展示在外泌体表面。他们构建了两种融合蛋白：一种是将CD38胞外域融合到血小板衍生生长因子受体(PDGFR)跨膜区(TMD)的N端；另一种是将全长CD38融合到外泌体标志蛋白CD9的C端。通过免疫印迹和酶活性分析，他们发现CD9-CD38融合蛋白在外泌体上的表达水平更高，且催化活性显著强于CD38-PDGFR融合蛋白。因此，他们选择CD9-CD38外泌体作为后续化学工程化的基础平台。

偶联Alexa 488荧光团的ARC Exos

为了验证该平台能否实现位点特异性功能化，研究人员首先合成了带有叠氮基团的2'-Cl-araNAD⁺共价抑制剂(2'-Cl-araNAD⁺-N₃)。该抑制剂能特异性地与CD38活性位点的谷氨酸226(E226)残基形成稳定的共价键。随后，通过点击化学反应，将DBCO-Alexa 488染料连接到外泌体上，成功制备了Alexa 488-ARC Exos。共聚焦显微镜和纳米流式细胞术分析证实，这种标记方法比传统的脂溶性染料PKH67更均一、更高效，且不影响外泌体的粒径分布。

展示FA配体和MMAF载荷的ARC Exos的设计与分析

接下来，研究人员将目光投向了更具应用价值的靶向配体和治疗载荷。他们合成了叶酸(FA)和微管蛋白抑制剂单甲基澳瑞他汀F(MMAF)的2'-Cl-araNAD⁺偶联物。通过简单的孵育反应，成功制备了FA-ARC Exos和MMAF-ARC Exos。ELISA和细胞结合实验表明，FA-ARC Exos能特异性结合叶酸受体α(FRα)阳性的癌细胞。更重要的是，他们将FA和MMAF同时偶联到外泌体上，构建了FA-MMAF-ARC Exos。体外细胞毒性实验显示，与不携带FA的MMAF-ARC Exos相比，FA-MMAF-ARC Exos对FRα阳性癌细胞的杀伤效力提高了9-16倍，而对FRα阴性细胞则没有选择性杀伤作用，证明了靶向递送的有效性。

骨靶向BP功能化ARC Exos的合成与评估

为了展示该平台的通用性，研究人员选择了骨靶向小分子双膦酸盐(BP)进行功能化。他们合成了2'-Cl-araNAD⁺-BP，并通过一步酶促反应制备了BP-ARC Exos。体外结合实验表明，BP-ARC Exos能高效、特异地结合羟基磷灰石(HAp)和天然骨组织，而未经修饰的外泌体则几乎不结合，证明了骨靶向功能的成功赋予。

骨靶向ARC Exos用于癌症免疫治疗的设计与表征

为了将骨靶向功能与免疫治疗相结合，研究人员设计了一种更复杂的多功能外泌体。他们通过共转染技术，在外泌体表面同时表达了CD38酶、靶向T细胞CD3的单链抗体(scFv)和靶向表皮生长因子受体(EGFR)的单链抗体。随后，通过2'-Cl-araNAD⁺-BP偶联，最终生成了BP-aCD3-aEGFR-ARC Exos。这种外泌体被设计用于通过BP靶向骨转移灶，通过aEGFR结合肿瘤细胞，并通过aCD3招募和激活T细胞，从而实现对骨转移癌的精准免疫攻击。体外实验证实，该外泌体能同时结合T细胞和EGFR阳性癌细胞，并能促进T细胞在骨组织上对肿瘤细胞的杀伤。

BP偶联ARC Exos的体外和体内抗肿瘤免疫及特异性

在体外，BP-aCD3-aEGFR-ARC Exos能有效激活T细胞（表现为CD25和CD69表达上调，以及IL-2和IFN-γ分泌增加），并选择性地杀伤EGFR阳性癌细胞，而对EGFR阴性细胞无影响。在体内，研究人员建立了人源化免疫重建的NSG小鼠模型，将EGFR阳性的人乳腺癌细胞BT-20植入小鼠胫骨旁，模拟骨转移。治疗结果显示，与对照组相比，BP-aCD3-aEGFR-ARC Exos治疗组的小鼠肿瘤生长被显著抑制，骨转移灶中的T细胞浸润显著增加，骨密度得到保护，且未观察到明显的全身毒性。

骨靶向ARC Exos在体内的抗转移疗效和毒性

为了进一步评估其抗转移能力，研究人员使用了更具侵袭性的MDA-MB-231乳腺癌细胞模型。结果显示，BP-aCD3-aEGFR-ARC Exos不仅能有效抑制原位骨肿瘤的生长，还能显著降低癌细胞向肺、肝、肾、脑和对侧肢体的远处转移率，表现出强大的抗转移活性。同时，各项毒理学指标均未显示明显的毒性反应，证明了该疗法的良好安全性。

本研究成功开发了一种基于ADP-核糖基环化酶(CD38)的外泌体化学工程通用平台(ARC Exos)。该平台利用CD38与其共价抑制剂2'-Cl-araNAD⁺的特异性反应，实现了外泌体表面小分子功能基团的位点特异性、均一性偶联。研究人员通过该平台成功制备了多种功能化外泌体，包括荧光标记、靶向递送和骨靶向免疫治疗外泌体，并在体外和体内验证了其优异的生物活性和特异性。特别是骨靶向免疫治疗外泌体(BP-aCD3-aEGFR-ARC Exos)，在骨转移癌模型中展现了强大的抗肿瘤和抗转移疗效，且安全性良好。这项研究不仅为外泌体的精准功能化提供了一种通用、高效的新策略，也为开发针对骨转移等难治性疾病的创新疗法提供了新的思路和工具。