抗CRISPR蛋白AcrIIA5增强引导编辑活性与安全性的机制与应用研究

《Nature Communications》：Anti-CRISPR protein AcrIIA5 can enhance the activity and security of prime editing

本研究针对引导编辑(PE)系统存在的编辑效率不足和副产物indels（插入/缺失）较多的问题，通过引入抗CRISPR蛋白AcrIIA5，开发了AcrIIA5辅助的引导编辑(aPE)系统。研究发现，AcrIIA5可显著提升多种PE架构（PE2/PE3/PE4/PE5/PE6）的编辑效率（最高提升8.2倍），同时大幅降低indels产生。机制上，AcrIIA5通过抑制SpCas9-H840A的重复切口活性而非增强核心编辑机制来发挥作用。该研究为优化PE系统的特异性与活性提供了新策略，拓宽了Acr蛋白在基因编辑领域的应用前景。

　　

基因编辑技术的进步为生命科学研究和疾病治疗带来了革命性的突破，但精准、安全地修改基因组仍然是领域内的核心挑战。传统的CRISPR/Cas9系统通过产生DNA双链断裂(DSB)进行编辑，但这会引发不可预测的插入和缺失(indels)，甚至导致大规模基因组重排，存在安全隐患。碱基编辑器(BE)能够在不断裂DNA双链的情况下实现特定碱基的转换，但也面临产物纯度低、旁观者编辑和脱靶等问题。引导编辑(Prime Editing, PE)系统的出现为解决这些难题提供了新思路，它无需DNA双链断裂或供体DNA模板，即可精确安装碱基替换、小片段插入或缺失。然而，PE系统，尤其是其高效版本PE3和PE5，仍会产生明显的副产物indels，且在DNA错配修复(MMR)不活跃的细胞系（如HEK293T）中，其编辑效率提升有限。此外，PE4系统中用于抑制MMR的MLH1dn蛋白尺寸较大，不利于腺相关病毒(AAV)载体的包装。这些局限性制约了PE系统的广泛应用，尤其是在临床治疗场景中。因此，开发能够同时提高PE编辑效率和安全性的新策略具有重要意义。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员意外地发现，一种已知的CRISPR“抑制剂”——源自噬菌体的抗CRISPR(Acr)蛋白AcrIIA5，竟能显著增强PE系统的性能。研究人员系统地评估了AcrIIA5对多种基因编辑工具的影响，包括SpCas9、多种胞嘧啶碱基编辑器(CBE)以及PE2系统。令人惊讶的是，虽然AcrIIA5正如预期那样抑制了SpCas9和CBE的活性，但它却显著提高了PE2在HEK293T细胞中引入特定碱基转换（如HEK3位点的+1 T-to-A）的效率。这一反直觉的发现促使研究人员深入探索AcrIIA5在PE系统中的作用。

为开展研究，研究人员主要运用了分子克隆构建各种PE系统、Acr蛋白及其突变体的表达载体；通过脂质体转染和脂质纳米粒(LNP)包裹mRNA/pegRNA等方式将编辑组件递送至多种人源细胞系（如HEK293T、HeLa、U2OS、HepG2）；利用靶向扩增子高通量测序和CRISPResso2分析软件精确量化编辑效率和indels频率；通过蛋白质印迹(Western blot)分析蛋白表达水平；进行体外DNA切割实验以探究AcrIIA5对SpCas9及其切口酶变体催化活性的影响；并利用流式细胞术和ELISA评估了在HepG2细胞中编辑PCSK9基因后的功能学后果（PCSK9蛋白分泌水平和Dil-LDL摄取能力）。

AcrIIA5可增强PE活性

研究人员首先确认了AcrIIA5对PE2系统的增强效果具有剂量依赖性。在HEK3位点进行+1 T-to-A编辑时，低剂量的AcrIIA5（与PE2的摩尔比为0.1）能使编辑效率从6.7%提升至24.9%，同时将indels从1.4%显著降低至0.7%。随着AcrIIA5剂量增加，其对PE效率的提升效果逐渐减弱，甚至在高剂量时产生抑制。这表明AcrIIA5对PE活性的调节存在一个最佳窗口。

探究aPE引入的碱基转换

研究人员系统测试了AcrIIA5对PE2在HEK3位点+1至+6位置引入所有可能碱基突变的影响。结果发现，aPE2的增强效果具有明显的位点依赖性：在+1至+4位置，aPE2引入的所有类型碱基转换效率均显著高于PE2，平均提高3.4倍，最高提升达5.3倍（+4 T-to-C）；相反，在+5和+6位置，aPE2的效率则明显低于PE2。同时，aPE2在所有位点引起的indels均显著降低。在HEK2、HEK5、HEK6等其他内源位点也观察到了类似的规律：aPE2对PAM（原间隔序列邻近基序）近端（通常为+1至+3/+4）的编辑有增强作用，而对PAM区域（+5, +6）或其附近的编辑则可能抑制。综合分析表明，AcrIIA5对PE2活性的增强作用与碱基转换类型无关，而主要取决于被编辑碱基在靶点中的位置。

aPE与多种结构的兼容性

研究表明，AcrIIA5与多种PE架构兼容。在PE2、PE3、PE4、PE5系统中，aPE（即对应PE架构与AcrIIA5联用）均能提高编辑效率并降低indels。特别值得注意的是，在MMR缺陷的HEK293T细胞中，aPE2的编辑效率（平均提升2.6倍）甚至超过了更复杂的PE3（仅提升1.31倍）和PE5系统。此外，aPE2引起的indels降低程度（4.5倍）也优于PE4中MLH1dn的效果（1.66倍）。鉴于AcrIIA5蛋白尺寸（140个氨基酸）远小于MLH1dn（752个氨基酸），其在AAV递送系统中更具优势。研究人员还发现AcrIIA5与工程化pegRNA（如epegRNA）、逆转录酶(RT)突变体（如PE2-PA）、新型PE系统（如PE6系列、PEmax、PE2_NC等）以及PAM识别范围更广的SpRY-H840A为基础的PE系统均具有良好的兼容性，能进一步提升其编辑性能。

评估aPE引入的缺失和插入

除了碱基转换，PE系统还能介导DNA小片段的缺失和插入。研究发现，aPE2对1-3个核苷酸(nt)的缺失效率平均提升至PE2的1.73倍、1.68倍和1.14倍，但对4-6 nt的缺失效率则低于PE2，再次体现了位置依赖性。在+1位点进行的1-6 nt插入编辑中，aPE2也显示出普遍增强的效果（1.14至1.92倍）。更重要的是，aPE2在所有这些编辑中均能显著降低伴随的indels，证明了其高安全性。

检查aPE引入的致病突变

为了评估aPE系统的治疗潜力，研究人员测试了其在12种致病突变安装中的表现。结果显示，aPE2能提升其中50%突变的编辑效率，并在75%的测试案例中改善了整体性能（效率提升或indels降低）。在杜氏肌营养不良症(DMD)相关突变c.5287C>T和神经纤维瘤病(NF1)相关突变c.1059del的校正中，aPE系统，特别是aPE2△RNaseH，展现了较高的编辑效率。

评估aPE在不同细胞系中的普适性

在HeLa和U2OS细胞系中，aPE2同样表现出比PE2更高的编辑效率和相当或更低的indels频率，表明其增强效果具有跨细胞系的普适性。

AAV和LNP递送评估

研究人员尝试了AAV和LNP两种递送策略。由于分裂式PE2蛋白通过内含肽(Intein)拼接需要时间，AAV递送AcrIIA5对PE的增强效果有限。而LNP递送全长PE2△RNaseH和AcrIIA5的mRNA则取得了成功，在HEK293T细胞中显著提高了编辑效率。更重要的是，在肝细胞HepG2中，LNP递送的aPE系统成功编辑了PCSK9基因的内含子1剪接供体位点，导致PCSK9蛋白分泌减少和低密度脂蛋白(LDL)摄取能力增强，证明了其治疗高胆固醇血症等疾病的潜在价值。

PBS和RTT并非aPE活性的决定因素

通过改变pegRNA中引物结合位点(PBS)的长度和逆转录模板(RTT)的长度（即右侧同源臂RHA的长度），研究发现这些参数的改变虽然会影响PE本身的效率，但并未逆转AcrIIA5对特定位置编辑的增强或抑制趋势，表明PBS和RTT并非AcrIIA5调节PE活性的决定性因素。

aPE位置依赖性效应的机制洞察

机制探究表明，AcrIIA5并不影响PE2蛋白的表达水平。其增强效应与靶位点初始的SpCas9切割活性密切相关。通过深度学习模型DeepSpCas9预测的切割分数与aPE:PE效率变化倍数之间存在正相关关系：在预测切割分数高（>50）的位点，aPE通常表现更好；而在预测切割分数低（<50）的位点，aPE效率可能下降。研究人员提出模型：对于非PAM沉默编辑（PAM近端或远端），AcrIIA5对SpCas9-H840A切口酶活性的“温和”抑制，足以减少其对已编辑链的重复切割（re-nicking），从而允许逆转录产物更稳定地整合，提高编辑效率并减少因重复切割引发的indels。而对于PAM沉默编辑（如改变PAM序列的编辑），其本身已能阻止重复靶向，额外的AcrIIA5抑制可能过度削弱初始切口活性，反而降低编辑效率。体外生化实验进一步证实，AcrIIA5对SpCas9-H840A（RuvC结构域活性）的抑制效果强于对SpCas9-D10A（HNH结构域活性），且这种抑制是不完全的，这与提出的“温和”抑制模型相符。

AcrIIA5介导PE活性增强的分子基础

与其他Acr蛋白（如AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA4）普遍抑制PE活性不同，AcrIIA5对PE的增强作用具有独特性。对AcrIIA5及其同源蛋白AcrIIA5-D1126（后者抑制PE活性）进行点突变和结构域分析发现，AcrIIA5的N末端内在无序区(IDR)中的带正电荷残基（如RKR motif）以及α3-α4环附近的区域对其增强PE活性至关重要。将这些关键区域映射到AcrIIA5的三维结构上，发现它们聚集在蛋白的同一表面，提示这可能是一个与SpCas9相互作用的功能界面。

研究结论与讨论部分强调，本研究意外地发现并证实了经典的SpCas9抑制剂AcrIIA5能够作为PE系统的有效增强剂，显著提高其编辑效率并降低副产物indels，这拓宽了Acr蛋白的功能认知。机制上，AcrIIA5可能通过适度抑制SpCas9-H840A的活性，减少其对已编辑链的重复切割，从而优化PE过程。aPE系统具有广泛的兼容性，适用于多种PE架构、细胞类型和递送方式，并在致病突变校正模型中展现出治疗潜力。尽管存在效果因靶点位点而异、对长片段插入/删除增强效果相对较弱等局限性，但通过DeepSpCas9等工具预测靶点活性有助于优化aPE的应用。该研究为开发更精准、安全的基因编辑工具提供了新思路，并启示可能存在更多能精细调控CRISPR系统的Acr蛋白。