锰工程化罗伊氏乳杆菌通过增强抗肿瘤活性与免疫调节作用预防和治疗结直肠癌

《Nature Communications》：Manganese-engineered Lactobacillus Reuteri with enhanced antitumor and immunomodulatory activities for colorectal cancer prevention and treatment

本研究针对结直肠癌(CRC)益生菌疗法存在的肿瘤靶向性差和肿瘤微环境内生物活性有限等挑战，报道了一种锰工程化的罗伊氏乳杆菌(MnLR)。口服MnLR及其代谢底物甘油(MnLR/Gly)能促进益生菌及其抗肿瘤代谢物在结肠肿瘤内富集。在多种临床前模型中，MnLR/Gly单药即可显著抑制原位肿瘤生长、减少肝转移，并诱导持久的抗肿瘤免疫。该研究为CRC的预防和治疗提供了一种高效、安全的独立益生菌疗法。

　　

结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)是全球范围内发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤，尤其对于发生转移的晚期患者，治疗选择有限且预后极差。尽管化疗和免疫检查点抑制剂等疗法取得了一定进展，但大多数CRC患者由于肿瘤新抗原负荷低、免疫细胞浸润不足以及免疫抑制性肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)等因素，对现有治疗手段反应不佳。此外，目前尚缺乏能够有效预防或延迟CRC发生的成熟药物策略。在此背景下，利用肠道益生菌进行生物治疗展现出广阔前景，然而，天然益生菌在复杂的体内环境中面临着肿瘤靶向能力弱、定植效率低、抗肿瘤代谢产物产量有限等诸多瓶颈，限制了其作为独立抗癌药物的应用。

为了突破这些限制，研究人员将目光投向了金属离子工程化改造益生菌这一新兴领域。金属离子对于维持细菌的结构稳定性、增强催化活性以及调控基因表达至关重要。其中，锰离子(Mn²⁺)已知能增强细菌的氧化应激抵抗能力，并调节宿主先天免疫信号通路。那么，能否利用锰离子来“武装”一种具有潜在抗肿瘤活性的益生菌，从而提升其对抗结直肠癌的战斗力呢？发表在《Nature Communications》上的一项研究给出了肯定的答案。该研究团队开发了一种锰工程化的罗伊氏乳杆菌(Manganese-engineered Lactobacillus reuteri, MnLR)，发现其与甘油联合口服后，能高效靶向结肠肿瘤，并通过产生细胞毒性代谢物和激活强大的抗肿瘤免疫，在多种临床前模型中实现了对结直肠癌的有效预防和治疗。

本研究综合运用了微生物培养与活性评估、化学修饰与材料表征、细胞共培养与免疫细胞功能分析、多种小鼠结直肠癌模型（包括原位移植瘤、自发成瘤Apc^min/+模型、肝转移模型）以及兔原位CRC模型，并采用了转录组学、蛋白组学、流式细胞术、免疫荧光、ELISA、16S rRNA测序等多种技术方法评估其疗效、免疫调节机制及安全性。人源样本包括结直肠癌患者来源的类器官(Patient-Derived Organoid, PDO)和健康捐赠者来源的外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)。

L. reuteri来源的甘油代谢物表现出氧化还原依赖的CRC抑制作用并富集结肠肿瘤内的多种肿瘤相关免疫细胞

研究人员首先证实，罗伊氏乳杆菌代谢甘油产生的混合代谢物（主要活性成分为罗伊氏菌素Reuterin，即3-羟基丙醛，3-HPA）能通过诱导活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)生成和氧化应激，选择性抑制结直肠癌细胞和患者来源类器官的生长，而对正常细胞毒性较低。值得注意的是，混合代谢物的抑癌效果优于纯罗伊氏菌素，提示代谢物中存在其他未知的抗癌成分。在皮下荷瘤小鼠模型中，口服代谢物能有效抑制肿瘤生长，并增加肿瘤微环境中巨噬细胞、树突状细胞(Dendritic Cell, DC)和CD8⁺T细胞的浸润，表明其除直接细胞毒性外，还可能具有免疫调节作用。

L. reuteri经过锰化学修饰后其增殖、甘油代谢和生物粘附能力得到增强

通过筛选，研究人员发现锰离子能浓度依赖性地促进罗伊氏乳杆菌的增殖和甘油代谢（以罗伊氏菌素产量衡量）。转录组和蛋白组分析表明，锰处理通过上调核糖体通路增强了细菌的蛋白质合成能力。进而，他们利用单宁酸(Tannic Acid, TA)作为连接剂，成功制备了锰表面修饰的罗伊氏乳杆菌(MnLR)。表征结果证实了锰的成功修饰。与未修饰的菌株相比，MnLR在体外表现出更强的增殖能力、罗伊氏菌素产量、生物膜形成能力以及对结肠癌细胞的粘附能力。更重要的是，MnLR在模拟胃液(Simulated Gastric Fluid, SGF)和模拟肠液(Simulated Intestinal Fluid, SIF)中均表现出比原始菌株更好的存活率，表明锰修饰增强了其对胃肠道环境的耐受性。

MnLR与甘油联用可在体外抑制结肠癌细胞生长并促进树突状细胞成熟

MnLR与甘油共培养(MnLR/Gly)产生的代谢物对多种微卫星不稳定状态（MSI-H和MSS）的人源和小鼠源结直肠癌细胞均表现出显著的生长抑制作用，且对正常细胞毒性较小。其作用机制与诱导免疫原性细胞死亡(Immunogenic Cell Death, ICD)有关，表现为钙网蛋白(Calreticulin, CRT)暴露、高迁移率族蛋白B1(High Mobility Group Box 1, HMGB1)和ATP释放。经MnLR/Gly处理的癌细胞裂解物能更有效地诱导小鼠骨髓来源的DC(mBMDC)和人PBMC来源的DC(hPBMC-DC)成熟（CD86⁺或CD83⁺比例升高），并促进IL-12和TNF等细胞因子分泌。此外，MnLR/Gly也能直接刺激DC成熟，该过程部分依赖于p38 MAPK信号通路。Mn²⁺和甘油代谢物在促进DC成熟中起协同作用。

MnLR与甘油联用可在体外驱动巨噬细胞向抗肿瘤表型极化

在巨噬细胞极化实验中，MnLR/Gly能显著促进脂多糖(LPS)和干扰素-γ(IFN-γ)诱导的M1型（促炎、杀伤肿瘤）巨噬细胞极化，同时抑制白细胞介素-4(IL-4)诱导的M2型（抗炎、促进肿瘤）巨噬细胞极化。在三维多细胞肿瘤球体(Multicellular Tumor Spheroid, MCT)模型中，MnLR/Gly与M1型巨噬细胞协同抑制肿瘤球生长，并逆转M2型巨噬细胞的促生长作用。机制研究表明，MnLR/Gly对巨噬细胞极化的调节部分依赖于缺氧诱导因子-1(Hypoxia-Inducible Factor-1, HIF-1)信号通路，且该通路的激活与ROS产生有关。在人PBMC来源的巨噬细胞中也观察到类似现象，并且MnLR/Gly处理后的巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力增强。

锰修饰提高了L. reuteri在结肠肿瘤部位的定植和代谢物分布且未引起小鼠全身性不良反应

在原位结肠癌小鼠模型中，口服MnLR后1小时即可在小肠和结直肠（肿瘤部位）检测到大量细菌，其富集量显著高于未修饰菌株，并且这种增强的定植可持续至少24小时。MnLR在肿瘤组织中的积累量也高于癌旁正常组织。更重要的是，口服MnLR/Gly一周后，小鼠结肠肿瘤、外周血和肝脏中的罗伊氏菌素浓度均显著高于口服原始菌株/Gly或纯罗伊氏菌素的组别。长期给药安全性评估显示，MnLR/Gly未引起明显的全身毒性或持续炎症反应，各主要器官功能指标和病理形态均正常，且未观察到锰蓄积。

口服MnLR与甘油可有效抑制小鼠原位结肠肿瘤生长并促进抗肿瘤巨噬细胞、成熟DC和效应T细胞

在原位结肠癌模型中，口服MnLR/Gly表现出最强的肿瘤生长抑制效果（抑制率达95.6%），其疗效优于单纯罗伊氏菌素、原始菌株/Gly，甚至优于PD-1抗体、5-氟尿嘧啶(5-FU)和帕尼单抗等标准疗法，并能显著延长小鼠生存期。机制上，MnLR/Gly处理显著增加了肿瘤组织内M1型巨噬细胞、成熟DC以及分泌干扰素-γ(IFN-γ)的CD4⁺和CD8⁺T细胞的比例，同时减少了M2型巨噬细胞。此外，在脾脏和肠系膜淋巴结(Mesenteric Lymph Node, MLN)等外周免疫器官中也观察到了抗肿瘤免疫细胞的激活，表明其能引发系统性抗肿瘤免疫。通过抗体或氯膦酸盐脂质体分别清除CD8⁺T细胞或巨噬细胞，只能部分削弱MnLR/Gly的疗效，说明其抑瘤作用是多机制共同参与的。MnLR/Gly还能部分逆转肿瘤引起的肠道菌群失调，富集潜在有益菌属，且在抗生素清除肠道菌群的小鼠中，其抗肿瘤效果仅轻微减弱，表明肠道菌群调节是其作用机制之一而非全部。

口服MnLR与甘油可有效预防小鼠原位原发性结肠肿瘤的发生和肝转移

在预防性给药实验中，预先口服MnLR/Gly能有效抑制初次肿瘤接种后的原发性结肠肿瘤形成，并使75%的小鼠在8周内保持无瘤状态。在肿瘤再攻击实验中，62.5%的预保护小鼠能抵抗第二次肿瘤接种，表明MnLR/Gly能诱导持久的免疫记忆。在Apc^min/+自发肠癌模型中也证实了其预防效果。这种预防作用与脾脏中M1/M2巨噬细胞比例升高、DC成熟以及MLN中效应T细胞增多相关。在肝转移模型中，MnLR/Gly能显著降低肝脏转移瘤负荷和结节数量，其效果依赖于CD8⁺T细胞和巨噬细胞。

GlyMnLR肠溶胶囊在兔体内有效抑制原发性结肠肿瘤生长且不引起全身性不良反应

为解决胃酸对细菌活性的影响，研究团队制备了以甘油为基质的肠溶胶囊(GlyMnLR)用于口服递送。该胶囊在胃液中保持完整，在肠液中快速溶解释放MnLR和甘油。在兔原位CRC模型中，每日口服一次GlyMnLR胶囊显示出显著的抗肿瘤疗效，优于游离MnLR和罗伊氏菌素胶囊，且略优于5-FU化疗。免疫荧光分析证实该胶囊能抑制肿瘤细胞增殖(Ki67阳性率降低)并促进CD8⁺T细胞在肿瘤中浸润，同时表现出良好的全身安全性。

结论与展望

该研究成功开发了一种通过锰离子表面修饰增强其生物活性的工程化罗伊氏乳杆菌MnLR。口服MnLR与甘油联用，不仅能利用其代谢产物对结直肠癌细胞产生选择性杀伤，还能通过重塑局部和全身抗肿瘤免疫（促进DC成熟、M1型巨噬细胞极化及效应T细胞应答）以及调节肠道菌群，实现对结直肠癌的有效治疗和预防。研究还通过设计肠溶胶囊剂型，解决了口服益生菌的胃酸耐受问题，并在大动物（兔）模型中验证了其有效性和安全性。这项工作将一种常见的益生菌成功提升为一种具有独立抗癌潜力的高效、安全微生物制剂，为结直肠癌的防治提供了新策略，并为工程化益生菌的开发和临床转化提供了重要参考。未来需要进一步鉴定混合代谢物中除罗伊氏菌素外的其他活性成分，并探索锰修饰策略是否适用于其他益生菌以增强其靶向治疗能力。