IDH2乳酸化修饰通过阻断Cav1-eNOS相互作用促进糖尿病心肌梗死后的血管新生

《Nature Communications》：IDH2 lactylation promotes angiogenesis in murine diabetic myocardial infarction via blocking Cav1-eNOS interaction

糖尿病心肌梗死(DMI)后血管新生障碍是导致心功能恶化的关键因素。本研究通过蛋白质组学筛选发现，IDH2在K272位点的乳酸化修饰在DMI中显著上调。机制上，IDH2-K272la通过增强与Cav1的结合，竞争性抑制Cav1对eNOS的负向调控，从而激活eNOS/NO通路，促进内皮细胞增殖、迁移和成管。研究进一步揭示了ACAT1/HDAC1作为IDH2的乳酸化修饰酶，以及MCT1介导的乳酸转运在其中的关键作用。此外，SGLT2抑制剂恩格列净(EMPA)通过上调IDH2-K272la发挥心脏保护作用。该研究为DMI的治疗提供了新的潜在靶点。

　　

论文解读

研究背景：糖尿病心肌梗死的“血管修复困境”

心肌梗死(MI)是导致心力衰竭和死亡的主要原因之一。在心肌梗死发生后，心脏会启动一个复杂的修复过程，其中，血管新生(Angiogenesis)是修复受损心肌、维持心功能的关键环节。新生的血管能够为缺血区域输送氧气和营养，减少梗死面积，并抑制不良的心室重构。

然而，在糖尿病患者中，这一关键的修复过程却严重受损。高血糖的微环境会抑制血管新生，导致糖尿病心肌梗死(DMI)患者的预后比非糖尿病患者更差。因此，深入探究DMI后血管新生障碍的分子机制，并寻找有效的干预靶点，具有重要的临床意义。

近年来，乳酸(Lactate)作为一种重要的信号分子，其非代谢功能逐渐受到关注。在缺氧和高糖环境下，细胞会通过糖酵解产生大量的乳酸。乳酸不仅是能量代谢的产物，还能作为一种“修饰基团”，通过乳酸化(Lactylation)修饰，在蛋白质的赖氨酸(Lysine)残基上添加一个乳酸基团，从而改变蛋白质的功能，参与基因表达调控和细胞信号转导。

已有研究表明，乳酸化修饰在心肌梗死后的心脏修复中扮演着重要角色。例如，组蛋白的乳酸化可以激活修复相关基因的表达，促进血管新生。然而，在糖尿病心肌梗死这一复杂的病理背景下，乳酸化修饰的具体作用及其调控机制尚不明确。

异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)是线粒体三羧酸循环(TCA)中的关键酶，负责催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸(α-KG)。除了其经典的代谢功能外，IDH2还参与多种细胞活动的调控。研究表明，IDH2可以通过不同的翻译后修饰（如去乙酰化、去琥珀酰化）来调节其活性，从而在心脏肥大、氧化应激和肿瘤发生中发挥作用。然而，IDH2是否会发生乳酸化修饰，以及这种修饰在DMI后血管新生中的作用，仍是一个未知的领域。

关键技术方法

本研究综合运用了多种前沿技术手段，系统性地揭示了IDH2乳酸化在DMI中的功能与机制。主要技术方法包括：

1. 1.
   蛋白质组学分析：利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术，对DMI小鼠心脏梗死边缘区的蛋白质进行了乳酸化修饰组学分析，筛选出差异表达的乳酸化蛋白，并鉴定出IDH2-K272为关键修饰位点。
2. 2.
   基因工程小鼠模型：构建了内皮细胞特异性IDH2-K272R点突变敲入(IDH2^EC-K272R)小鼠，用于在体验证IDH2乳酸化在DMI中的功能。
3. 3.
   分子互作与结构模拟：通过免疫共沉淀(Co-IP)、免疫共沉淀-质谱联用(IP-MS)技术，结合ZDOCK SERVER和PDBePISA软件进行分子对接模拟，揭示了IDH2与Cav1、ACAT1、HDAC1等蛋白的相互作用及其结合结构域。
4. 4.
   细胞功能学实验：利用原代小鼠心脏微血管内皮细胞(CMECs)，通过CCK-8、Edu、划痕愈合、成管实验和NO活性检测，评估了IDH2乳酸化对内皮细胞增殖、迁移、成管能力及eNOS活性的影响。
5. 5.
   药理学干预：使用ACAT1抑制剂Avasimibe、HDAC1抑制剂Entinostat、MCT1抑制剂AZD3965以及SGLT2抑制剂恩格列净(EMPA)等工具药，在细胞和动物水平上验证了相关通路在DMI治疗中的潜在价值。

研究结果

1. 糖尿病心肌梗死显著上调心脏蛋白乳酸化水平

研究人员首先构建了糖尿病心肌梗死(DMI)小鼠模型，并证实DMI小鼠的心脏功能受损更严重，梗死面积更大，血管新生能力更差，心肌纤维化程度更高。为了探究乳酸化修饰在DMI中的作用，他们利用泛乳酸化抗体(Pan Kla)检测了心脏组织中的乳酸化水平。结果显示，与单纯心肌梗死(MI)组相比，DMI组心脏梗死边缘区的蛋白乳酸化水平显著升高。这一发现提示，乳酸化修饰可能参与了DMI的病理过程。

2. 蛋白质组学筛选鉴定IDH2-K272为关键乳酸化位点

为了深入探究DMI中乳酸化修饰的具体变化，研究人员对Sham、MI和DMI小鼠的心脏组织进行了乳酸化修饰蛋白质组学分析。他们鉴定出了237个乳酸化蛋白，共805个乳酸化位点。通过比较DMI组与MI组的差异，发现IDH2蛋白的K272位点乳酸化水平上调最为显著。生物信息学分析进一步显示，这些差异乳酸化蛋白主要富集于三羧酸循环(TCA)等能量代谢通路，提示乳酸化可能通过调控代谢关键酶来影响DMI后的心脏修复。

3. IDH2-K272乳酸化促进内皮细胞功能

为了验证IDH2乳酸化的功能，研究人员在体外模拟了DMI的病理环境（高糖+缺氧，HOD），处理原代心脏微血管内皮细胞(CMECs)。结果发现，HOD处理显著上调了IDH2的乳酸化水平，而IDH2的总蛋白表达量没有变化。通过构建IDH2-K272R突变质粒（模拟乳酸化缺失），研究人员发现，K272R突变显著抑制了内皮细胞的增殖、迁移和成管能力。这些结果表明，IDH2-K272的乳酸化是维持内皮细胞功能所必需的。

4. 内皮细胞特异性IDH2-K272R突变加重DMI损伤

为了在体验证IDH2乳酸化的功能，研究人员构建了内皮细胞特异性IDH2-K272R点突变敲入(IDH2^EC-K272R)小鼠。在DMI模型中，与野生型(IDH2^WT)小鼠相比，IDH2^EC-K272R小鼠的心脏功能更差，梗死面积更大，血管新生能力更弱，心肌纤维化程度更严重。这些结果在动物水平上证实，内皮细胞中IDH2-K272的乳酸化对于DMI后的心脏修复具有保护作用。

5. IDH2乳酸化通过竞争性结合Cav1激活eNOS

机制上，研究人员发现IDH2乳酸化能够增强其与Cav1蛋白的结合。Cav1是内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的负向调控蛋白，其与eNOS的结合会抑制eNOS的活性，从而减少一氧化氮(NO)的生成。通过分子对接和结构域截断实验，研究人员证实IDH2与Cav1的结合位点位于Cav1的脚手架结构域(CSD)，而eNOS也通过该结构域与Cav1结合。因此，IDH2乳酸化后，通过竞争性地与Cav1结合，解除了Cav1对eNOS的抑制作用，从而激活eNOS/NO通路，促进血管新生。

6. ACAT1和HDAC1分别作为IDH2的乳酸化酶和去乳酸化酶

研究人员进一步探究了调控IDH2乳酸化的“书写器”和“擦除器”。通过IP-MS筛选和功能验证，他们发现乙酰辅酶A乙酰转移酶1(ACAT1)能够与IDH2结合，并作为乳酸转移酶(Lactyltransferase)促进IDH2-K272的乳酸化；而组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)则作为去乳酸化酶(Delactylase)去除IDH2-K272的乳酸化修饰。在DMI的高糖缺氧环境下，ACAT1表达上调，HDAC1表达下调，共同促进了IDH2的乳酸化。

7. MCT1介导乳酸转运促进IDH2乳酸化

乳酸是乳酸化修饰的底物。研究人员发现，外源性补充乳酸可以促进IDH2的乳酸化，而单羧酸转运蛋白1(MCT1)抑制剂AZD3965可以阻断这一过程。这表明，在DMI环境下，乳酸通过MCT1转运进入内皮细胞，为IDH2的乳酸化提供了底物。

8. 恩格列净通过促进IDH2乳酸化发挥心脏保护作用

最后，研究人员探索了靶向IDH2乳酸化的治疗策略。他们发现，SGLT2抑制剂恩格列净(EMPA)能够显著促进IDH2-K272的乳酸化。在DMI小鼠模型中，恩格列净治疗能够改善心脏功能，促进血管新生，减轻心肌纤维化。然而，在IDH2^EC-K272R小鼠中，恩格列净的心脏保护作用被部分削弱。这表明，恩格列净的心脏保护作用至少部分是通过促进内皮细胞IDH2-K272乳酸化来实现的。

研究结论与意义

本研究首次揭示了IDH2-K272乳酸化在糖尿病心肌梗死(DMI)后血管新生中的关键作用及其分子机制。研究团队发现，在DMI的高糖缺氧微环境下，乳酸通过MCT1转运进入内皮细胞，在乳酸转移酶ACAT1和去乳酸化酶HDAC1的共同调控下，促进了IDH2蛋白第272位赖氨酸的乳酸化修饰。乳酸化后的IDH2与Cav1蛋白的结合能力增强，竞争性地阻断了Cav1对eNOS的抑制作用，从而激活eNOS/NO信号通路，最终促进了内皮细胞的增殖、迁移和成管，改善了DMI后的心脏修复。

该研究的科学意义在于：

1. 1.
   揭示了乳酸化修饰在心血管疾病中的新功能：将乳酸化修饰的研究从组蛋白等核蛋白拓展到了线粒体代谢酶IDH2，阐明了乳酸化作为一种重要的信号转导方式，在连接代谢重编程与血管功能调控中的桥梁作用。
2. 2.
   阐明了DMI后血管新生障碍的新机制：提出了“IDH2乳酸化-Cav1-eNOS”轴是DMI后血管新生障碍的关键调控通路，为理解DMI的病理生理机制提供了新的视角。
3. 3.
   为DMI的治疗提供了新的潜在靶点：IDH2-K272乳酸化及其调控酶ACAT1/HDAC1，以及MCT1介导的乳酸转运，均可作为潜在的干预靶点，为开发新的治疗策略提供了理论依据。
4. 4.
   阐明了恩格列净心脏保护作用的新机制：首次揭示了恩格列净通过促进IDH2乳酸化来发挥心脏保护作用，为其在心血管疾病中的临床应用提供了新的分子药理学解释，也为其他SGLT2抑制剂的心血管获益机制研究提供了重要线索。

该研究由江苏大学附属医院心内科王忠群教授团队完成，相关成果已发表于《自然·通讯》(Nature Communications)杂志。