血小板生成素通过增强EVI1+造血干细胞易感性加速KMT2A-MLLT3驱动急性髓系白血病的机制研究

《Nature Communications》：Thrombopoietin increases susceptibility for EVI1?+?KMT2A-MLLT3-driven AML expressing stem cell genes linked to poor outcome

本研究针对EVI1表达、KMT2A重排急性髓系白血病（AML）的细胞起源问题，通过构建Evi1-GFP报告基因诱导性iKMT2A-MLLT3小鼠模型（KME），发现单次血小板生成素（TPO）刺激可特异性增加循环Evi1+造血干细胞（HSC）数量，并加速AML发生。该HSC起源的AML高表达IL12Rβ2、INPP4B等干细胞基因，与患者不良预后相关。敲低实验证实MECOM为EVI1highOCI-AML4细胞特有依赖，而IL12Rβ2敲低可广泛抑制AML细胞集落形成。研究表明TPO等外源因子可通过调控HSC周期增加KMT2A融合基因驱动白血病的易感性。

　　

在血液系统的恶性肿瘤中，急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）以其高度的遗传异质性和临床侵袭性而备受关注。其中，涉及赖氨酸甲基转移酶2A（KMT2A，也称为MLL1）基因重排的AML（KMT2A-rearranged AML, KMT2A-r AML）占据了相当比例，尤其在婴幼儿和部分成人患者中预后较差。KMT2A基因会与超过80种不同的伴侣基因发生融合，产生致癌的融合蛋白，如常见的KMT2A-MLLT3（亦称MLL-AF9）融合基因。这些融合蛋白能够异常地激活或维持造血干细胞和祖细胞（Hematopoietic Stem and Progenitor Cells, HSPC）的干性，从而驱动白血病的发生。然而，一个长期困扰研究者的问题是：究竟哪种类型的造血细胞是KMT2A融合基因转化的“起源细胞”（Cell of Origin）？是相对静止的长期造血干细胞（Long-Term Hematopoietic Stem Cells, LT-HSC），还是更为活跃、定向分化的髓系祖细胞，如粒-巨噬细胞祖细胞（Granulocyte-Macrophage Progenitors, GMP）？先前的研究似乎给出了矛盾的线索。一些研究表明，快速增殖的GMP由于其活跃的细胞周期，可能更容易被逆转录病毒表达的KMT2A融合基因转化。而另一些研究，包括使用可诱导转基因小鼠模型（inducible transgenic mouse model）的工作则提示，当转化事件发生在更原始的HSC compartment时，可能会诱发更具侵袭性、且常常伴随高表达Ecotropic病毒整合位点1（Ecotropic Virus Integration Site 1, EVI1）转录因子的白血病亚型。EVI1的高表达是AML一个独立的负面预后指标，它不仅见于伴有3q26染色体畸变的病例，也常见于无此畸变但伴有KMT2A重排的AML中。那么，是什么因素决定了白血病是起源于HSC还是祖细胞？外界的刺激，例如细胞因子或模拟感染的信号，是否会改变不同造血细胞对致癌转化的“易感性”（Susceptibility）？为了解决这些关键问题，由巴塞尔大学（University of Basel）的Juerg Schwaller教授团队领导的研究小组，在《Nature Communications》上发表了一项重要研究。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了几个关键的技术方法。他们首先将Evi1-IRES-GFP报告基因小鼠与可诱导表达KMT2A-MLLT3融合基因的小鼠（iKMT2A-MLLT3）杂交，创建了名为“KME”的复合基因小鼠模型，从而能够在体内实时追踪Evi1的表达。利用流式细胞术（Flow Cytometry）精确分选不同的造血干细胞和祖细胞群体。通过单次注射血小板生成素（Thrombopoietin, TPO）、Poly(I:C)或5-氟尿嘧啶（5-FU）等外源刺激物，并结合细胞周期分析（通过Ki-67和DAPI染色）和骨髓移植实验，评估这些刺激对HSC行为及白血病发生的影响。在分子机制层面，研究采用了单细胞RNA测序（Single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）和批量RNA测序（Bulk RNA sequencing）来全面分析TPO刺激后以及最终形成的白血病细胞的基因表达谱。此外，还利用短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）介导的基因敲低（Knockdown, KD）技术在人类AML细胞系（如OCI-AML4, MOLM-13, THP-1, HL-60）和小鼠原代白血病细胞中进行了功能验证实验。研究还整合分析了来自TARGET、BEAT、LEUCEGENE和圣裘德（ST. JUDE）医院四个大型公共数据库的人类AML患者的基因表达和临床数据。

TPO而非5-FU或poly(I:C)可增加Evi1⁺HSC的数量

研究人员首先探究了不同外源刺激对正常小鼠造血干细胞中Evi1表达的影响。他们向携带Evi1-GFP报告基因的小鼠单次注射TPO、TPO受体激动剂Romiplostim（RP）、模拟病毒双链RNA的poly(I:C)或化疗药物5-FU。结果发现，与磷酸盐缓冲液（PBS）对照组相比，单次TPO或RP注射48小时后，能显著增加骨髓中LT-HSC的数量，并特别选择性地提高了Evi1^highLT-HSC、多能祖细胞1（Multipotent Progenitor 1, MPP1）和MPP2的比例。而5-FU和poly(I:C)处理虽然也改变了HSPC的数量，但却降低了Evi1^highLT-HSC的比例。这表明TPO对Evi1⁺HSC的扩增作用具有特异性。通过高分辨率骨髓三维成像技术，研究人员直观地证实了TPO处理后小鼠骨髓中Evi1⁺c-Kit⁺（即造血干/祖细胞）的密度显著增加。

TPO暴露增加Evi1^highLT-HSC和MPP1的细胞周期进程

既然TPO能增加Evi1⁺HSC的数量，那么其机制是什么？已知TPO是调控HSC静息状态的关键因子。通过细胞周期分析（Ki-67/DAPI染色），研究发现，在稳态下，LT-HSC的细胞周期（S/G₂/M期）比例低于MPP1。TPO刺激后，总体LT-HSC的细胞周期变得更为活跃。当进一步根据Evi1表达水平细分时，发现了一个有趣的现象：TPO刺激使得Evi1^neg（阴性）的LT-HSC更多地进入G₀静息期，而Evi1^high和Evi1^low的LT-HSC则显示出细胞周期进程的增加。对TPO受体Mpl的表面表达分析显示，其表达量与细胞的原始程度（LT-HSC > MPP1 > MPP2 > MPP3）以及Evi1的表达水平呈强正相关（Pearson系数r=0.9）。TPO注射后，Mpl受体在Evi1^highHSC上发生了显著的下调，这是受体激活后内化降解的典型反馈调节现象。这些数据共同说明，TPO通过其受体Mpl，选择性地促进了表达高水平Mpl和Evi1的HSC进入细胞周期。

TPO增加集落形成能力并加速iKMT2A-MLLT3驱动的AML

接下来，研究人员想知道TPO引起的Evi1⁺HSC变化是否会影响其被KMT2A-MLLT3融合基因转化的效率。他们将经TPO或PBS预处理后的KME小鼠的骨髓细胞（或分选出的LT-HSC/MPP1）在含有诱导剂多西环素（Doxycycline, DOX）的甲基纤维素培养基中进行集落形成实验。结果显示，来自TPO预处理供体的细胞形成了更多数量的集落，并且其中具有侵袭性、未成熟形态的“IV型”集落比例更高。更重要的是，在体内白血病模型中，将等数量的、经TPO或PBS预处理的KME LT-HSC或MPP1移植给经致死量照射的小鼠后，发现接受TPO刺激细胞的小鼠，其AML发病时间显著缩短。这些患病小鼠表现出典型的iKMT2A-MLLT3 AML特征，如体重减轻、脾脏肿大和多器官白血病细胞浸润。并且，在发病小鼠的骨髓中，Evi1⁺白血病细胞的比例更高，且Evi1的表达水平与疾病潜伏期（从移植到发病的时间）呈负相关。这表明，TPO预处理不仅加速了疾病进程，还促进了Evi1⁺白血病亚型的产生。

TPO刺激快速调节iKMT2A-MLLT3 HSPC的基因表达

为了在分子层面了解TPO的早期效应，研究人员对经TPO或PBS处理后、再诱导表达iKMT2A-MLLT3融合基因2天和5天的Evi1^highFlt3^-LSK（Lin^-Sca-1⁺c-Kit⁺）细胞进行了单细胞转录组和细胞表面蛋白测序（CITE-seq）。整合分析定义了20个细胞簇，涵盖了从最原始的LT-HSC到髓系祖细胞的连续分化状态。差异表达分析发现，在诱导2天后，TPO处理就在几个早期干细胞簇（如ST-HSC_2）中上调了与白血病侵袭性和干性相关的基因，如Cd74和Socs2。基因集富集分析（GSEA）显示，与HOXA9、干扰素/STAT信号相关的通路被激活。到第5天，在LT-HSC簇中发现了与白血病干性相关的同源盒转录因子Pbx3的上调，而在增殖活跃的祖细胞簇中，则出现了Fos、Junb等TPO/Mpl信号下游转录因子的上调。GSEA再次提示Hoxa9相关通路、G₂/M期检查点、Myc激活等通路富集。这表明，TPO注射能迅速而持续地改变iKMT2A-MLLT3 HSC的转录程序，使其更倾向于增殖和转化。

iKMT2A-MLLT3 AML表达签名反映其起源于TPO暴露的HSC

对最终形成的白血病细胞进行批量RNA测序分析发现，起源于TPO预处理HSC的白血病细胞，其基因表达谱与起源于PBS预处理HSC的白血病细胞明显分离。前者高表达Evi1及其推定靶基因Erg，水平甚至高于既往报道的HSC起源的iKMT2A-MLLT3 AML。差异表达基因分析发现了大量与TPO/Mpl信号通路（如JAK-STAT、MAPK、NF-κB）以及HOXA9活性相关的基因签名被显著富集。这强烈提示，TPO刺激在HSC层面留下的“印记”能够持续影响最终形成的白血病的分子特征。

比较小鼠与人类EVI1⁺AML表达签名发现与不良预后相关的HSC基因

为了验证小鼠模型中发现的相关性，研究人员分析了四个大型人类AML队列（TARGET, BEAT, LEUCEGENE, ST. JUDE）的基因表达数据。根据MECOM（编码EVI1的基因）和ERG的表达水平对患者进行聚类后，比较EVI1^high和EVI1^intermediate患者之间的差异表达基因，并与小鼠Evi1⁺AML的签名进行交叉比对。结果发现了一批在物种间共同失调的基因。其中，MECOM、IL12Rβ2（白细胞介素12受体β2亚基）和INPP4B（肌醇多磷酸-4-磷酸酶II型B）这三个基因在小鼠和所有四个人类队列的EVI1⁺AML中均一致性地高表达。相关性分析显示，在患者中，MECOM与IL12Rβ2和INPP4B的表达呈正相关。生存分析进一步证实，高表达这些基因（尤其是EVI1、IL12Rβ2和INPP4B）的患者，其总体生存期显著更短。这些基因在正常造血中也主要高表达于HSC，这从另一个角度佐证了这类AML的HSC起源特性。

在人类KMT2A重排AML细胞中对共同高表达DEG进行功能验证

最后，研究团队在细胞水平上验证了这些共同高表达基因的功能重要性。他们筛选出唯一一株同时具有KMT2A重排（KMT2A-MLLT1）、高表达EVI1（无3q26畸变）、且表达MPL受体的人类AML细胞系OCI-AML4。利用可诱导的shRNA系统分别敲低MECOM、MPL、IL12Rβ2、INPP4B和HOXA9。结果发现，敲低MECOM能显著抑制OCI-AML4细胞在液体培养中的生长和集落形成能力，证明OCI-AML4细胞对MECOM存在特异性依赖。有趣的是，敲低IL12Rβ2也显著损害了OCI-AML4细胞的集落形成，并且还意外地导致MECOM mRNA表达水平下降约50%，提示二者可能存在交叉调控。敲低INPP4B对OCI-AML4和EVI1^low的MOLM-13细胞均有轻微的生长抑制效果。值得注意的是，在EVI1表达水平很低或不表达的MOLM-13、THP-1和HL-60细胞系中，敲低IL12Rβ2同样能抑制其集落形成能力，这表明IL12Rβ2的作用可能不依赖于EVI1的状态，具有更广泛的意义。在小鼠原代Evi1^highiKMT2A-MLLT3 AML细胞中敲低Mecom或Il12rβ2，也观察到了克隆形成能力的下降。

综上所述，这项研究通过巧妙的基因工程小鼠模型，首次清晰地证明，一个单一的外源因子——血小板生成素（TPO），能够通过特异性促进Evi1⁺造血干细胞的细胞周期进程，显著提高其对KMT2A-MLLT3融合癌基因转化的易感性，从而诱发一种高表达Evi1、具有HSC分子特征、且侵袭性更强的急性髓系白血病。研究不仅揭示了TPO/Mpl-EVI1-HOXA9/STAT5轴在白血病起始中的重要作用，还通过跨物种生物信息学分析鉴定出IL12Rβ2、INPP4B等一批在HSC起源的EVI1⁺AML中共同高表达、且与患者不良预后相关的关键基因，并进行了初步的功能验证。这项工作的意义在于，它将外源微环境信号、造血干细胞的固有状态（EVI1表达）和遗传驱动事件（KMT2A重排）有机地联系起来，为理解AML，特别是高危EVI1⁺AML的细胞起源和发病机制提供了新的视角。研究发现提示，临床上某些可能导致TPO水平异常升高的情况（如化疗后血小板反弹性增多或使用TPO受体激动剂治疗骨髓增生异常综合征），理论上可能会增加EVI1⁺HSC的转化风险，尽管这种风险在实际中可能因驱动事件的低发生率而显得很低。此外，鉴定出的IL12Rβ2等新型依赖基因，为开发针对这类难治性AML的靶向治疗策略提供了潜在的候选靶点。未来的研究需要进一步探索其他可能影响HSC周期和白血病易感性的外源因素，并深入阐明IL12Rβ2等在白血病细胞中发挥作用的具体分子机制。