基于抗体类别转换重组连接的免疫与DNA修复功能障碍分类新方法SWIBRID

《Nature Communications》：Recombination junctions from antibody isotype switching classify immune and DNA repair dysfunction

本研究针对当前免疫缺陷和DNA双链断裂修复缺陷检测方法的局限性，开发了SWIBRID技术平台，通过分析体内B细胞抗体类别转换重组过程中产生的基因组连接特征，实现了对免疫功能和DNA修复能力的精准评估。研究证明该技术能有效区分不同DNA修复基因缺陷，在68例患者中准确识别免疫缺陷和DNA修复缺陷，为临床诊断提供了新工具。

　　

在免疫学和基因组稳定性研究领域，准确评估个体的免疫功能和DNA修复能力一直是临床诊断和基础研究的重大挑战。适应性免疫应答依赖于通过抗原受体体细胞多样化产生的多样化免疫细胞库，这一过程涉及程序性诱导和DNA双链断裂修复的复杂网络。当这些修复通路出现缺陷时，不仅会损害适应性免疫系统，还会危及基因组完整性，导致癌症、放射敏感性、早衰、神经退行性疾病或发育障碍等多种疾病。

目前，新生儿筛查技术如TREC和KREC已彻底改变了与T细胞和B细胞缺陷相关的先天性免疫错误的早期识别。然而，这些检测方法在识别常见变异型免疫缺陷症患者中观察到的缺陷抗体反应方面存在不足。虽然基因检测能够识别导致癌症和影响治疗的单基因缺陷，但单基因高风险突变在人群中并不常见，而多因素疾病通常由许多组合的低风险变异驱动。因此，评估单个基因或蛋白质缺陷的方法不太可能反映免疫系统和DNA修复景观的整体性能。

受到数十年利用B细胞研究DNA修复过程的启发，由Clara Vázquez García和Benedikt Obermayer等研究人员在《Nature Communications》上发表的最新研究，开发了一种名为SWIBRID的创新工具，能够系统分析B细胞抗体类别转换重组过程中体内产生的基因组连接。这类CSR连接反映了免疫多样性和DNA修复能力，为评估免疫功能和DNA修复缺陷提供了新的视角。

研究人员建立的技术方法主要包括：从血液样本中提取B细胞，通过特异性引物设计进行CSR连接位点的PCR扩增，采用MinION或PacBio长读长测序技术获取序列数据，并开发专门的生物信息学分析流程对测序数据进行处理。该流程包括数据去复用、序列比对、质量控制、聚类分析、变异检测和特征提取等步骤，最终从CSR连接中提取68个特征参数，涵盖结构异常、序列背景、断点矩阵、多样性测量和同种型组成等五大类别。

系统分析CSR连接的实验方法建立

研究团队首先优化了PCR扩增方案，使用4条带条形码的引物同时评估不同同种型的分离CSR连接。在人类免疫球蛋白重链基因座中，正向引物结合在人类Sμ区域上游565bp处，而针对Sγ、Sα和Sε的反向引物则结合在各自S区域下游特定位置。通过仅进行25个PCR循环，在最大限度减少技术噪音的同时确保充分代表生物多样性。将扩增产物进行纳米孔长读长测序后，研究人员设计了专门的生物信息学流程，包括序列比对、层次聚类和特征提取等步骤。

通过对单克隆、寡克隆和多克隆B细胞样本的分析，验证了SWIBRID管道能够准确量化CSR克隆的多样性。在单克隆细胞系中检测到两个主要CSR克隆，与两个转换等位基因一致；寡克隆系显示多个转换等位基因；而原代人类B细胞的多克隆样本则显示出高且均匀分布的多样性。此外，研究人员还将该方法应用于小鼠模型，验证了其在不同物种中的适用性。

CSR连接特征反映免疫能力和DNA修复状态

研究团队建立了一套完整的特征提取策略，将完整数据集浓缩为68个特征向量，涵盖五大类别：结构异常、序列背景、断点矩阵、多样性测量和同种型组成。这些特征中，结构异常和序列背景特征预计反映不同DNA修复通路的表现，断点矩阵代表DNA修复通路参与和免疫性能的综合测量，而多样性测量和同种型组成则反映免疫系统应对威胁的能力。

通过对98个样本的大规模数据分析，研究人员验证了这些特征在不同批次和测序方法中的稳健性。大多数特征的变异主要由供体身份解释，而非技术批次效应或测序方法。研究人员最终选择了44个稳健特征用于后续分析，这些特征具有高供体身份解释方差百分比，且主要不受技术批次效应或测序方法影响。

DNA修复基因敲除的CSR连接特征识别

研究团队将SWIBRID应用于携带不同DNA修复因子单基因敲除的CH12小鼠细胞系，包括Lig4、Trp53bp1、Rif1和Brca1等基因。通过体外刺激诱导CSR后，分析发现不同基因敲除型显示出独特的CSR连接特征。例如，与野生型相比，Brca1敲除中直接从Sμ到任何其他S区域的直接转换频率显著更高；Trp53bp1和Lig4敲除中平均PCR产物长度显著更短，而Brca1敲除中则更长。

主成分分析显示，不同基因型在特征空间中良好分离，尽管Rif1敲除与Trp53bp1敲除样本存在部分重叠。通过基于多项式岭回归模型的机器学习方法，研究人员成功预测了36个独立CH12样本的基因型，准确率达到35/36，交叉验证预测精度达94-96%。

CVID患者的准确识别与分类

研究人员将SWIBRID应用于21例CVID或相关诊断患者和14例对照的样本分析。结果显示，多种CSR特征在CVID患者和对照之间存在显著差异，包括单次断裂比例、断点周围序列微同源性、CSR克隆大小以及Sγ2或Sγ3同种型分配簇的比例等。主成分分析显示，对照与CVID患者以及由特定免疫缺陷引起的CVID样疾病良好分离。

通过机器学习方法，SWIBRID几乎完美地将CVID和CVID样患者与对照样本区分开来，对独立测试数据集的预测准确率均值达0.92。尽管模型是在CVID数据上训练的，但对DNA修复相关缺陷样本的识别仍达到0.84的AUC分数，表明该方法具有高灵敏度和特异性。

对CVID训练和测试队列的聚类分析识别出三个不同的患者组：簇1主要包括对照、非典型和亚类缺陷样本；簇2和簇3包含患者样本。簇2显示非模板插入频率增加，Sα CSR克隆频率极低，Sγ1较高；而簇3显示所有Sγ同种型比例下降，整体多样性测量较差。簇3与ATM缺陷共享特征，如Sγ1减少、非模板插入和开关内缺失减少，以及同源性增加，提示簇3可能具有DNA修复缺陷特征。

研究结论与意义

SWIBRID技术的开发为系统评估免疫能力和DNA修复功能提供了创新工具。与直接基因分型和单基因疾病分类相比，高通量CSR连接测序可用于揭示复杂的人类缺陷，如临床意义未知的突变、罕见复合杂合性状、表观遗传缺陷或跨基因的良性变异协同效应。

在临床应用中，SWIBRID能够可靠识别CVID和DNA修复缺陷个体，即使在转换记忆B细胞数量极少的情况下也能检测患者特异性特征。该方法超越了当前流式细胞术等技术的检测能力，为患者分层提供了更精确的工具。特别值得注意的是，一个CVID患者组表现出与共济失调毛细血管扩张症相似的特征，提示SWIBRID可能用于诊断放射敏感性和较高癌症风险，这在CVID临床管理中具有重要意义。

该研究的创新之处在于同时捕获DNA修复相关的CSR结构改变和同种型组成，实现了超越常规免疫表型分析的B细胞功能障碍详细评估。对于抗体紊乱或功能异常B细胞和T细胞患者，即使VDJ多样性保持正常，SWIBRID也能提供有价值的诊断信息，因为它专注于仅在免疫应答或疫苗接种背景下出现的转换B细胞。

研究人员还观察到不同物种间的特征差异，如CH12野生型细胞与人类B细胞共享部分但不全部特征，这不能仅用其限于IgA转换来解释，可能反映了影响小鼠与人类SWIBRID特征的S区域不同基因组结构。

总体而言，SWIBRID技术有潜力推进我们对DNA修复缺陷的机制理解，并有助于揭示70-90%遗传未定免疫缺陷患者的潜在分子原因。除了严重疾病患者外，识别轻微免疫功能障碍可能有助于通过指导预防措施更好地保护感染易感个体。