CAT1介导阳离子氨基酸转运与病毒受体识别的结构基础及其在跨物种病毒感染中的意义

《Nature Communications》：Structural insights into cationic amino acid transport and viral receptor engagement by CAT1

本研究通过冷冻电镜解析了mCAT1与FrMLV病毒受体结合域及底物鸟氨酸的复合物结构，揭示了CAT1作为阳离子氨基酸转运蛋白和逆转录病毒受体的双重作用机制。研究发现mCAT1通过物种特异性的第三胞外环（ECL3）实现病毒特异性识别，其刚性结构由二硫键和π-π堆叠作用稳定，这为理解病毒跨物种传播障碍和开发靶向CAT1的癌症/传染病治疗策略提供了结构框架。

　　

在细胞代谢与病毒感染的交汇处，阳离子氨基酸转运蛋白1（CAT1）扮演着双重角色。它不仅是维持细胞稳态的关键转运蛋白，负责精氨酸、鸟氨酸和赖氨酸等必需氨基酸的跨膜运输，更令人惊讶的是，它还能被某些逆转录病毒“劫持”作为入侵细胞的“特洛伊木马”。尤其是Friend小鼠白血病病毒（FrMLV），正是通过特异性结合小鼠源的CAT1（mCAT1）来开启感染之门。然而，长期以来，科学家们对CAT1如何同时精准执行这两项截然不同的任务——即“营养转运”和“病毒受体”——的分子细节知之甚少。究竟是什么结构特征让CAT1能够识别特定的氨基酸？又是哪些关键区域决定了病毒能够识别小鼠的CAT1，却对人类或其他动物的CAT1“视而不见”，从而限制了病毒的宿主范围？这些问题的答案，对于理解基础生物学过程以及开发针对依赖CAT1的癌症（如某些急性白血病）和病毒感染的疗法至关重要。

近日，发表在《Nature Communications》上的一项研究成功揭开了这一谜团。由陈学敏、夏凌云和杨阳共同领导的研究团队，利用冷冻电镜（cryo-EM）技术，首次解析了全长mCAT1与其底物鸟氨酸以及FrMLV病毒受体结合域（frRBD）形成的三元复合物高分辨率结构。这一突破性的结构不仅展示了mCAT1在向内开口闭塞状态下的精细构象，揭示了其识别和转运阳离子氨基酸的分子机制，更清晰地描绘了病毒蛋白如何精确“锚定”在mCAT1的胞外区域，特别是物种特异性差异显著的第三胞外环（ECL3），从而阐明了FrMLV宿主特异性的结构基础。

为开展此项研究，作者主要应用了以下几项关键技术：利用哺乳动物细胞（HEK293F）表达系统制备mCAT1和frRBD蛋白，通过冷冻电镜单颗粒分析技术解析复合物三维结构（分辨率3.65 ?），采用生物层干涉技术（BLI）定量分析蛋白-蛋白相互作用亲和力，通过分子动力学（MD）模拟评估底物结合稳定性，并利用假病毒侵染实验和电生理记录进行功能验证。

mCAT1/frRBD复合物的整体结构

研究人员成功纯化了mCAT1与frRBD的复合物，并通过冷冻电镜解析了其3.65 ?的结构。结构显示，mCAT1呈现出独特的14次跨膜螺旋拓扑结构，其中包括12个核心跨膜螺旋（TM1-TM12）和2个辅助螺旋（ATM1和ATM2）。frRBD以1:1的化学计量比结合在mCAT1的胞外域上方，相互作用界面面积约728 ?2。结构清晰地显示，mCAT1在结合鸟氨酸后处于向内开口的闭塞构象，为理解其转运周期提供了关键快照。

mCAT1的鸟氨酸结合位点

在mCAT1的转运路径中心，研究人员观察到了清晰的电子密度，并通过分子动力学模拟验证该位置被底物鸟氨酸占据。结构分析表明，鸟氨酸的识别依赖于多个保守的极性残基：其主链氨基与Y257存在潜在的阳离子-π相互作用，羧基与S44、G47（TM1）和S343（TM8）形成亲水相互作用，侧链氨基则与S347（TM8）形成潜在的氢键。功能实验证实，突变Y257、S343或S347会显著降低鸟氨酸诱导的电流，说明这些残基对底物识别和转运至关重要。值得注意的是，与细菌同源蛋白GkApcT利用谷氨酸（E115）进行质子耦合转运不同，mCAT1中对应的残基是丝氨酸（S120），这与其作为膜电位驱动、不依赖质子的转运蛋白特性相符。

向内开口闭塞状态与门控机制

在解析的结构中，mCAT1的胞外门户被Y257（TM6）与TM1、TM3、TM8上的残基协同关闭，而胞内门户相对开放但仍有狭窄通道。结合AlphaFold3的构象预测和点突变功能分析，研究人员提出Y257和F349分别作为胞外和胞侧的门控残基，通过构象变化调控底物的跨膜转运。

mCAT1作为FrMLV受体特异性识别frRBD

结构分析揭示了病毒识别的精细界面，可划分为三个相互作用区域（Patch 1-3）。Patch 1涉及frRBD的可变区A（VRA）与mCAT1的ECL3之间的极性相互作用；Patch 2是一个由主链介导的氢键网络，构成界面的稳定核心；Patch 3则包含潜在的盐桥（如frRBD的R119'与mCAT1的E60）。此外，frRBD的W136'和P104'与mCAT1的Y235和F224之间存在CH/π或π-π堆叠作用，进一步稳定复合物。假病毒侵染实验和BLI结合实验证实，突变这些关键界面残基会削弱病毒进入或降低结合亲和力。

ECL3刚性编码FrMLV感染的物种特异性

序列比对显示，mCAT1的ECL3区域在物种间差异显著，特别是人类hCAT1（hCAT1）在该区域存在多个插入和关键残基替换。功能实验表明，表达mCAT1的细胞支持FrMLV高效进入，而表达hCAT1的细胞则不然。关键的域交换实验证明，ECL3是决定宿主范围的核心元件：将mCAT1的ECL3替换为人源序列（mCAT1-hLoop）会显著降低病毒感染，反之，将hCAT1的ECL3替换为鼠源序列（hCAT1-mLoop）则使细胞变得易感。进一步研究发现，连接ECL3和ECL4的二硫键（C226-C309）以及ECL1、ECL3、ECL4之间的π-π堆叠相互作用共同维持了ECL3的刚性构象，这对于形成高亲和力的病毒结合平台至关重要。突变C309会减弱但并非完全消除结合和感染，表明二硫键主要起增强作用。

讨论与结论

本研究通过结构生物学、生物化学和细胞生物学等多学科手段，系统地阐明了mCAT1执行双重功能的分子基础。研究揭示了一个重要的功能分离现象：病毒通过结合物种特异性且结构可变的ECL3来实现感染，而这一过程并不干扰保守的跨膜核心所执行的氨基酸转运功能。这与ASCT2、NTCP等其他病毒受体转运蛋白的机制形成鲜明对比。研究还提出了mCAT1以膜电位驱动、不依赖钠离子/质子的交替存取模型，并明确了Y257和F349作为关键门控残基的作用。

最重要的是，该研究确立了ECL3的构象刚性及其序列特异性是决定FrMLV宿主范围的关键因素。非啮齿类动物（如人类）CAT1的ECL3关键残基不保守，从结构上解释了病毒无法感染这些物种的原因。由于CAT1在多种癌症的代谢重编程中扮演重要角色，其作为病毒受体的机制又关乎人畜共患病毒的风险评估，因此这项研究不仅具有重要的理论价值，也为未来开发针对CAT1的靶向药物（如抗癌药物或抗病毒制剂）提供了精确的分子蓝图和结构基础。