经典途径补体C3转化酶活性的结构解析揭示电荷转换催化机制

《Nature Communications》：Structural insights into C3 convertase activity of the classical pathway of complement

补体系统依赖C3转化酶切割C3，但其结构机制尚不明确。本研究通过冷冻电镜解析了经典/凝集素途径C3前转化酶(C4b2)、转化酶(C4b2b)及酶-底物复合物(C4b2b-C3)的三维结构，揭示了底物C3通过双重界面结合转化酶，其切割后产物C3b因MG7结构域电荷反转而被排斥，提出了补体转化酶催化周转的电荷转换新机制。

　　

在我们的免疫系统中，补体系统扮演着至关重要的角色，它是抵御病原体入侵的第一道防线，同时也参与清除体内凋亡细胞和免疫复合物，维持机体稳态。补体系统的活化主要通过三条途径进行：经典途径、凝集素途径和替代途径。无论哪条途径，其核心环节都依赖于C3转化酶对补体成分C3的切割，生成具有调理作用的C3b片段，后者可沉积在靶标表面（即“调理作用”），标记靶标以供免疫细胞清除。因此，C3转化酶被视为补体激活的“放大器”和“指挥中心”。

然而，这些关键的C3转化酶却是出了名的“短命鬼”，其半衰期仅有约1-1.5分钟，并且解离是不可逆的。这种特性一方面限制了补体激活的规模和持续时间，防止过度的炎症损伤；另一方面也给科学研究带来了巨大挑战，尤其是对其结构的解析困难重重。虽然替代途径的C3转化酶（C3bBb）的结构已有部分报道，但经典途径和凝集素途径的C3转化酶（由C4b和C2b组成，即C4b2b）的高分辨率结构，特别是其与底物C3结合的复合物结构，一直付之阙如。这严重阻碍了我们对不同补体激活途径中C3转化酶组装、底物识别及催化机制异同点的深入理解。例如，C3转化酶如何特异性识别并切割庞大的C3分子？切割产生的C3b产物如何被释放，以进行下一轮催化循环？这些基本问题长期悬而未决。

为了解决这些关键科学问题，来自荷兰乌得勒支大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们利用单颗粒冷冻电镜技术，成功解析了人类经典/凝集素途径补体C3前转化酶（C4b2）、C3转化酶（C4b2b）以及转化酶-底物复合物（C4b2b-C3）的近原子分辨率结构。这些结构如同分子世界的“高清电影”，首次直观地展示了从酶原组装、蛋白酶解激活到底物结合的全过程，并揭示了一种新颖的、由电荷反转驱动的产物释放机制，为理解补体系统的精密调控开辟了新视角。

本研究的关键技术方法主要包括：利用交叉链接和尺寸排阻色谱纯化C4b2前转化酶复合物；通过基因工程手段制备催化失活的C2突变体（S679A）和双纳米抗体（结合C3和C4b）以稳定瞬态的C4b2b-C3转化酶-底物复合物；最终使用300 kV Titan Krios和200 kV Talos Arctica冷冻电镜进行数据采集，并利用CryoSPARC软件进行单颗粒图像处理和三维重构，最终获得高分辨率结构。

研究结果

前转化酶结构

研究人员首先解析了C4b2前转化酶的整体结构，分辨率达3.5 ?。结构显示，C4b的构象与其自由状态相似，但其C345C结构域和TED结构域显示出一定的灵活性。C2通过其CCP2-3结构域与C4b的MG2、MG6-7和CUB结构域形成广泛的相互作用界面。同时，C2的VWA结构域通过其MIDAS位点与C4b C345C结构域的羧基末端结合。值得注意的是，C2的丝氨酸蛋白酶结构域在结构中呈现出高度动态的特征，其最常出现的位置靠近C4b的MG2、MG6和CUB结构域，且其底物切割环（scissile loop）是暴露且易于接近的，这种“开放”构象与替代途径的前转化酶C3bB类似，表明其易于被C1s或MASP蛋白酶激活。

转化酶结构

通过将C2的催化残基Ser679突变为丙氨酸（S679A）并利用C1s进行蛋白水解切割，研究人员获得了C4b2b转化酶的结构，分辨率为4.2 ?。与C4b2相比，C4b2b的结构发生了显著变化：随着C2a（包含CCP1-3和螺旋aL）的移除，C2b的VWA结构域相对于C4b主体旋转了34°，而C2b的SP结构域则相对于VWA发生了高达124°的旋转。这些结构重排导致催化活性中心移动了33 ?，并重新定向了底物结合槽。这一巨大的构象变化解释了转化酶形成后其催化特性的根本性改变。

转化酶-底物复合物结构

最关键的结构突破在于C4b2b-C3复合物的解析，分辨率达到3.5 ?。结构清晰地显示，底物C3通过两个独立的界面与转化酶中的C4b组分结合。第一个界面由C3和C4b的MG4-5结构域形成，这与之前在金葡菌补体抑制剂SCIN稳定的C3bBb二聚体中观察到的C3b-C3b同源二聚界面相似。第二个界面则是一个新发现的界面，主要由C3的MG7结构域与C4b的MG6、MG7以及α‘NT区域相互作用形成。为了形成这个界面，C3自身发生了显著的构象变化，其MG3、ANA和MG7结构域分别旋转了33°、10°和15°，导致整个分子的α-β链取向改变了9°。这些变化使得C3的底物切割环能够移动约6 ?，从而准确地插入C2b SP结构域的底物结合槽中。切割环上的Leu746、Arg748和Ser749分别占据了S3、S1和S1’口袋，催化三联体和氧阴离子孔也已形成催化活性构象。

讨论与结论

这项研究通过一系列高分辨率冷冻电镜结构，描绘了经典/凝集素途径C3转化酶从组装、激活到底物识别的完整分子路径。研究揭示了几个关键机制：

1. 1.
   转化酶稳定性：C2/C4b（或Factor B/C3b）之间在MIDAS位点之外的相互作用较弱，这使得酶解后产生的Bb或C2b片段无法重新与C3b或C4b结合，解释了转化酶不可逆解离的特性。同时，激活过程中VWA结构域的构象变化可能使其MIDAS处于高亲和力状态，这有助于解释转化酶约1-1.5分钟的半衰期。
2. 2.
   底物识别：C3通过MG4-5和MG7两个界面与转化酶结合，其中MG7界面是一个新的、由C3构象变化诱导产生的结合位点。这解释了为什么缺失MG7区域特定残基的C3突变体不能作为转化酶的底物。
3. 3.
   电荷转换产物释放机制：这是本研究提出的最引人注目的新机制。通过比较C4b2b-C3（酶-底物）和SCIN抑制的C3bBb二聚体（作为酶-产物复合物的模型），研究人员发现，在底物C3中，其MG7结构域表面带正电荷，与转化酶C4b MG7的负电荷表面相互吸引。然而，当C3被切割成C3b后，其新产生的α’NT片段会结合到自身MG7结构域的沟槽中，导致MG7表面由正电荷转变为负电荷。这样一来，产物C3b的MG7与转化酶C4b的MG7之间产生静电排斥，从而促进了C3b的释放，为催化周转创造了条件。这种“电荷转换”机制巧妙地协调了底物结合和产物释放这两个关键步骤。

综上所述，该研究不仅填补了经典途径C3转化酶结构生物学的空白，更重要的是揭示了其催化周转的一种新颖的电荷依赖性调控机制。这些发现对于深入理解补体系统的活化与调控，以及开发针对补体过度活化相关疾病（如阵发性睡眠性血红蛋白尿、非典型溶血性尿毒症综合征、年龄相关性黄斑变性等）的新型治疗策略具有重要的理论指导意义。