一种新型TCR转基因小鼠模型揭示CD4+T细胞功能失调机制及其在肿瘤免疫治疗中的可逆性

《Nature Communications》：Dysfunctional CD4 T cells in an oncovirus-specific TCR-transgenic in vivo model

《自然-通讯》推荐：为解决慢性抗原暴露导致CD4+T细胞功能失调的机制不清问题，本研究构建了针对Moloney白血病病毒的特异性TCR转基因小鼠模型MolT-II。研究发现该模型CD4+T细胞呈现PD-1hiLAG-3hiCTLA-4hi的耗竭表型，其 dysfunction 与内源性逆转录病毒AKV交叉反应相关。通过肽段疫苗联合PD-1/LAG-3/CTLA-4三重阻断可成功恢复T细胞功能并增强抗肿瘤效应，为肿瘤免疫治疗提供了新思路。

　　

在肿瘤和慢性感染中，T淋巴细胞常常会进入一种功能失调的状态，即“T细胞耗竭”。这种状态下，T细胞失去有效的杀伤能力和细胞因子分泌功能，表面大量表达PD-1、LAG-3、CTLA-4等抑制性受体，如同被按下了“暂停键”。尽管CD8⁺T细胞的耗竭已被广泛研究，但作为免疫应答“指挥官”的CD4⁺T细胞的耗竭机制却如同一个“黑箱”，所知甚少。然而，CD4⁺T细胞在抗肿瘤免疫中扮演着多重关键角色：它们不仅能帮助CD8⁺T细胞激活与存活，还能直接杀伤肿瘤细胞或调控其他免疫细胞。因此，揭开CD4⁺T细胞耗竭的神秘面纱，对于开发更有效的癌症免疫疗法至关重要。

为了解决这一难题，由Felicia S. Spitzer、Marcel G.M. Camps、Cedrik M. Britten等研究人员组成的团队在《自然-通讯》上发表了一项重要研究。他们成功构建了一种名为“MolT-II”的新型T细胞受体转基因小鼠模型，该模型的CD4⁺T细胞特异性识别一种来自Moloney小鼠白血病病毒包膜蛋白的肽段（envH）。出人意料的是，这些本该英勇善战的“特种兵”在MolT-II小鼠体内却显得“萎靡不振”，表现出典型的功能耗竭特征。研究人员深入探索后发现，这种耗竭竟是由小鼠自身基因组中潜伏的内源性逆转录病毒“捣鬼”所致。更令人振奋的是，研究团队找到了让这些“疲惫”的T细胞重焕活力的方法：通过肽段疫苗接种联合靶向PD-1、LAG-3和CTLA-4的三重免疫检查点阻断疗法，能成功逆转CD4⁺T细胞的功能失调，并显著增强其对小鼠淋巴瘤的控制能力。这项研究不仅为理解CD4⁺T细胞耗竭提供了宝贵的体内模型，也为联合免疫治疗策略的开发带来了新的启示。

为开展本研究，作者主要应用了以下关键技术：通过显微注射构建TCRαβ转基因的MolT-II小鼠模型；利用流式细胞术系统分析脾脏、淋巴结、胸腺中T细胞亚群的数量、表型（包括CD44、CD62L、PD-1、LAG-3、CTLA-4等标志物）和功能（细胞内因子染色检测IL-2、TNF、CD40L）；采用CFSE染色检测T细胞增殖能力；通过体外共培养实验（使用D1树突状细胞系呈递抗原肽）评估T细胞对抗原肽的反应；建立胸腺基质细胞分选（cTECs, mTECs, DCs）及qPCR技术分析内源性抗原AKVenv的表达；利用双荧光素酶报告基因TbiLuc小鼠模型进行体内T细胞活化和定位的活体成像分析；并在C57BL/6小鼠体内进行抗体阻断（抗PD-L1、抗LAG-3、抗CTLA-4）、肽疫苗免疫以及RMA淋巴瘤模型实验，以评估治疗性干预效果。

结果部分

MolT-II小鼠中CD4 T细胞区室减少

研究人员发现，新构建的MolT-II小鼠绝大多数外周CD4⁺T细胞都表达转基因TCR Vβ6链。然而，与野生型C57BL/6小鼠和另一种TCR转基因小鼠OT-II相比，MolT-II小鼠脾脏、淋巴结和血液中的CD4⁺T细胞频率异常低下，CD8:CD4 T细胞比例显著升高至约1.7:1。虽然总CD3⁺T细胞数量相当，但MolT-II脾脏中CD4⁺T细胞的绝对数量显著减少，表明这些表达转基因TCR的CD4⁺T细胞在外周存在数量缺陷。

MolT-II CD4 T细胞对肽段刺激的效应功能降低

功能分析显示，与OT-II CD4⁺T细胞在识别其特异性卵清蛋白肽（ovaH）后产生强烈的CD40L、IL-2和TNF反应不同，MolT-II CD4⁺T细胞在遇到其特异性抗原envH时，仅能产生微弱的细胞因子表达。CFSE增殖实验进一步证实，即使在高浓度envH肽刺激下，MolT-II CD4⁺T细胞的增殖能力也远低于OT-II细胞。然而，当使用强效刺激（可溶性抗CD3和抗CD28抗体）时，MolT-II CD4⁺T细胞却能产生高水平的IL-2，甚至超过野生型和OT-II细胞，表明其功能缺陷并非不可逆转，而是与TCR信号强度或共刺激条件有关。

共抑制性检查点分子表达提示CD4 T细胞功能失调

MolT-II小鼠的调节性T细胞频率与野生型相当，排除了Treg介导的抑制是主要原因。相反，流式细胞术分析发现，初始MolT-II CD4⁺T细胞表面本就高表达PD-1、LAG-3、CTLA-4和TIM-3等共抑制分子，以及ICOS和OX40等共刺激分子。在用抗CD3抗体刺激后，这些检查点分子的表达进一步急剧上调，远超对照细胞。这种高表达抑制性受体、低细胞因子反应和弱增殖能力的组合，强烈提示MolT-II CD4⁺T细胞处于功能耗竭状态。

MolT-II CD4 T细胞识别交叉反应性内源性肽段配体

对T细胞记忆/激活标志物的分析发现，MolT-II小鼠的CD4⁺T细胞中初始型（CD62L⁺CD44^-）比例显著降低，而抗原经验型（CD44⁺）比例升高，提示它们在体内可能持续接触某种抗原。胸腺细胞分析显示，MolT-II小鼠胸腺中CD4⁺CD8⁺双阳性细胞比例减少，且胸腺内CD44⁺CD4⁺T细胞比例升高，这类似于自身反应性T细胞在胸腺中经历阴性选择的现象。通过序列比对，研究人员发现与envH高度同源的内源性肽段AKVenv，它源自内源性鼠逆转录病毒AKV的包膜蛋白，两者仅一个氨基酸之差（envH第124位为亮氨酸Leu，AKVenv第143位为酪氨酸Tyr）。qPCR分析证实AKVenv在胸腺髓质上皮细胞中特异性表达。功能实验表明，AKVenv肽能够诱导MolT-II CD4⁺T细胞发生弱增殖和产生较低水平的CD40L与TNF，证实了MolT-II TCR与内源性AKVenv肽存在交叉反应，这可能是导致胸腺内阴性选择和外周T细胞功能失调的关键原因。

体内MoIT-II CD4 T细胞功能失调

为了评估体内反应性，研究人员将表达双荧光素报告基因的TbiLucMolT-II CD4⁺T细胞过继转移到野生型小鼠体内。活体成像显示，尽管转移的T细胞存在（CBG99信号），但在用envH+CpG疫苗免疫后，其激活信号（PpyRE9信号）仅轻微增强，远低于对照TbiLucOT-II T细胞对ovaH疫苗的强烈反应。这直接证明了MolT-II CD4⁺T细胞在体内对特异性抗原刺激的反应能力严重受损。

功能失调的CD4 T细胞在体内疫苗接种和免疫检查点阻断后可恢复功能

基于检查点分子高表达的结果，研究人员尝试通过联合免疫干预来逆转功能失调。体内实验表明，单独使用抗PD-L1、抗LAG-3或抗CTLA-4抗体，或单独进行envH肽疫苗接种，对恢复MolT-II CD4⁺T细胞功能（IL-2、CD40L表达）效果有限。然而，当将envH疫苗接种与抗PD-L1、抗LAG-3和抗CTLA-4的三重抗体阻断联合使用时，能显著增强细胞因子产生，并引起疫苗引流淋巴结和脾脏中Vβ6⁺CD4⁺T细胞数量的显著扩增。重要的是，三重检查点阻断本身无效，必须与抗原刺激协同才能发挥作用，说明需要TCR信号（信号1）来启动恢复过程。

MolT-II T细胞在强效疫苗接种后可支持体内肿瘤控制

最后，研究团队在RMA淋巴瘤模型中检验了功能恢复的MolT-II CD4⁺T细胞的抗肿瘤能力。将MolT-II细胞过继转移给野生型小鼠后，用envH联合MuLV特异性CTL表位gagL的肽疫苗（在IFA佐剂中）进行免疫，能显著延迟肿瘤生长并将小鼠生存率从单用疫苗时的约40%提高至80%。这表明，一旦通过强效疫苗接种克服其功能失调状态，MolT-II CD4⁺T细胞能够有效发挥辅助功能，增强CD8⁺T细胞介导的肿瘤控制。

结论与讨论

本研究成功建立并表征了MolT-II这一新型TCR转基因小鼠模型，其CD4⁺T细胞因与内源性逆转录病毒抗原AKVenv的交叉反应而呈现功能耗竭表型。该模型模拟了癌症和慢性感染中常见的T细胞功能障碍状态。研究的关键发现在于，这种耗竭状态是可逆的。通过抗原特异性疫苗接种（提供信号1和佐剂信号）联合靶向多个关键共抑制通路（PD-1、LAG-3、CTLA-4）的检查点阻断，可以协同作用，重新激活这些“疲惫”的CD4⁺T细胞，并使其在抗肿瘤免疫中发挥有效的辅助功能。

这项研究的意义重大。首先，MolT-II模型为在体内深入研究CD4⁺T细胞耗竭的机制、评估新的免疫调节策略（如检查点抑制剂组合、CD40激动剂等）提供了一个独特的平台。其次，它强调了在肿瘤免疫治疗中，关注CD4⁺T细胞状态并设法逆转其耗竭的重要性。研究结果支持了一种联合治疗策略：即通过疫苗接种提供特异性抗原信号和强共刺激信号，同时解除多重免疫抑制，从而最大程度地重振耗竭的T细胞，最终改善肿瘤控制。总之，这项工作深化了对CD4⁺T细胞功能失调的理解，并为开发更有效的癌症免疫组合疗法提供了新的见解和实验工具。