柯萨奇病毒A6入侵宿主细胞的分子机制：KRM1作为脱壳受体及中和抗体的作用研究

《Nature Communications》：Molecular mechanisms of receptor recognition and antibody neutralization of coxsackievirus A6

本研究针对柯萨奇病毒A6（CVA6）感染机制不清的问题，系统阐明了其双受体入侵机制：硫酸乙酰肝素（HSPG）介导病毒附着，KRM1受体触发病毒脱壳。研究同时开发出靶向病毒衣壳新型抗原表位的中和抗体1F4/3H7，为HFMD防治提供了新策略。

　　

近年来，手足口病（HFMD）已成为全球性的公共卫生挑战，尤其在亚洲地区频繁爆发大规模疫情。传统上，这种疾病主要由肠道病毒A71（EV-A71）和柯萨奇病毒A16（CVA16）引起。然而，最新的流行病学调查显示，柯萨奇病毒A6（CVA6）已迅速崛起，在许多国家成为HFMD的主要病原体，其发病率甚至超过了EV-A71和CVA16。更令人担忧的是，CVA6感染常伴随非典型临床表现，如广泛的水疱大疱性皮疹、脱甲症，以及脑膜炎、心肌损伤和肺水肿等严重并发症。尽管CVA6的威胁日益加剧，目前尚未有获批的疫苗或特效药物。因此，深入解析CVA6的感染机制，并开发有效的防治手段，成为当务之急。

CVA6是一种无包膜RNA病毒，其衣壳呈二十面体对称结构。此前研究显示，CVA6存在三种不同的病毒颗粒形式：成熟病毒颗粒（virion）、脱壳中间体A颗粒（A-particle）和空颗粒（empty particle）。成熟病毒颗粒含有完整的RNA基因组和衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4），其VP1疏水口袋内存在一种称为"口袋因子"的脂质分子，能稳定病毒衣壳。A颗粒则失去了VP4，衣壳膨胀，口袋因子排出。空颗粒则不含病毒RNA。有趣的是，此前对CVA6原型株Gdula和临床株TW-141的研究发现，A颗粒是其主要存在形式，而成熟病毒颗粒极为罕见。这一发现曾引导学界认为A颗粒是CVA6的主要感染形式，并可能是疫苗开发的理想靶标。然而，这一结论仅基于有限毒株的研究，是否适用于所有CVA6毒株仍有待商榷。

在病毒入侵机制方面，许多肠道病毒采用双受体入侵策略：附着受体介导病毒与细胞的初始结合，脱壳受体则触发病毒构象变化和基因组释放。对于CVA6，目前已知的唯一细胞受体是Kringle结构域跨膜蛋白1（KREMEN1或KRM1），该受体同时也被CVA2、CVA3、CVA4、CVA5、CVA8、CVA10和CVA12等多种肠道病毒利用。虽然KRM1与CVA10的相互作用已有研究，但其在CVA6感染中的具体功能尚不明确。此外，CVA6是否利用其他受体也是一个未解之谜。

针对CVA6相关HFMD的防治，单克隆抗体（MAb）是极具前景的候选策略。然而，目前仅有一种CVA6特异性中和单克隆抗体（1D5）被报道，该抗体靶向病毒衣壳的五重对称轴顶点，通过阻断病毒附着发挥中和作用。显然，CVA6衣壳上必然存在其他抗原表位和中和机制，亟待探索。

为了系统阐明CVA6受体识别和抗体中和的分子机制，研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。该研究通过综合运用结构生物学、病毒学、免疫学等多种技术手段，揭示了CVA6入侵宿主细胞的新机制，并开发出具有临床应用潜力的中和抗体。

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用冷冻电镜（cryo-EM）解析CVA6病毒颗粒及其与受体、抗体复合物的高分辨率结构；通过基因敲除技术构建KRM1和SLC35B2（参与硫酸乙酰肝素磺化的关键基因）缺陷的RD细胞系，研究受体功能；采用杂交瘤技术制备CVA6特异性单克隆抗体；建立新生小鼠感染模型评估抗体的预防和治疗效果；运用生物层干涉技术（BLI）分析抗体与病毒的结合动力学；通过体外结合实验、竞争ELISA、时间相加实验等验证受体功能及抗体作用机制。

Development and characterization of neutralizing MAbs against CVA6

研究人员通过用纯化的CVA6-TW-141病毒颗粒免疫小鼠，成功筛选出两株具有强效中和活性的单克隆抗体1F4和3H7。中和实验显示，1F4和3H7对CVA6-141和CVA6-HeB毒株均表现出纳克级别的中和活性，而对CVA10无交叉反应，表明其高度特异性。体内实验进一步证明，这两株抗体在新生小鼠模型中能有效预防和治疗致死剂量的CVA6感染，显著提高存活率。

Neutralization mechanisms of MAbs 1F4 and 3H7

通过时间相加实验，研究发现1F4和3H7主要作用于病毒附着后的早期入侵阶段，对病毒初始附着影响很小。竞争性受体结合ELISA表明，这两种抗体能有效阻断KRM1与病毒的结合。这些结果提示KRM1可能不参与CVA6的初始附着，而是在附着后步骤中发挥关键作用。

KRM1 binding triggers uncoating of mature CVA6 virions

研究团队发现，与之前报道的CVA6毒株不同，临床分离株CVA6-HeB的纯化病毒颗粒主要由成熟病毒颗粒（93%）组成，未检测到A颗粒。更重要的是，当CVA6-HeB与KRM1受体孵育后，成熟病毒颗粒的比例从90%以上降至30%以下，而A颗粒则从无到有，成为主要组分（70%）。这一受体依赖的转换明确证实KRM1是CVA6的脱壳受体，能诱导成熟病毒颗粒向A颗粒转化。

Structural analysis of CVA6-KRM1 complex

冷冻电镜结构分析显示，KRM1结合在CVA6病毒颗粒的"峡谷"区域，横跨两个相邻的原聚体。KRM1通过其KR和WSC结构域与病毒衣壳的VP1、VP2和VP3蛋白发生广泛相互作用。特别值得注意的是，VP2 EF环上的K140残基与KRM1的多个残基形成氢键、盐桥和π-阳离子相互作用，该残基在KRM1依赖性肠道病毒中完全保守，对受体结合和病毒感染至关重要。

Cryo-EM structure of CVA6 in complex with 1F4 Fab reveals neutralization mechanism

1F4抗体与CVA6复合物的冷冻电镜结构显示，1F4以对称方式结合在病毒衣壳的三重对称轴附近，每个Fab片段与一个原聚体相互作用，主要结合在VP3 AB环和VP1 C末端。足迹分析表明，1F4的轻链可变区（VL）与KRM1结合区域直接重叠，能空间阻碍KRM1与病毒的结合。

Cryo-EM structure of CVA6 in complex with 3H7 Fab

3H7抗体也结合在病毒衣壳的三重对称轴附近，但其结合表位比1F4更广泛，涉及VP1 C末端、VP2 BC环和HI环、VP3 AB环和BI环。与1F4不同的是，3H7不仅能结合成熟病毒颗粒，也能结合膨胀的空颗粒。结构分析显示，3H7的轻链可变区部分重叠于KRM1结合位点，能空间阻碍KRM1的WSC结构域与病毒衣壳结合。

Comparison of the epitopes and binding kinetics of 1F4 and 3H7

尽管3H7的空间阻碍效应小于1F4，但其更广泛的表位识别和更慢的解离速率使其在竞争条件下能更有效地占据病毒颗粒，从而更有效地阻断受体结合。这一发现表明，有效的受体阻断不仅取决于空间阻碍程度，还与抗体的结合动力学特性密切相关。

Heparan sulfate mediates initial attachment of CVA6 to host cells followed by KRM1-dependent post-attachment entry

研究发现，KRM1敲除虽显著降低CVA6感染性，但不影响病毒附着；而SLC35B2敲除（影响硫酸乙酰肝素磺化）则同时损害病毒附着和感染。生化实验证实CVA6病毒颗粒能直接与肝素结合，且可溶性肝素能浓度依赖性地抑制CVA6与RD细胞的附着。病毒附着和内化实验进一步表明，KRM1缺失不影响病毒附着但严重损害病毒内化，而SLC35B2缺失则导致病毒附着和内化均显著减少。这些结果确立了CVA6的双受体入侵机制：硫酸乙酰肝素（HSPG）介导病毒初始附着，KRM1负责附着后的内化和脱壳。

本研究系统阐明了CVA6入侵宿主细胞的分子机制，颠覆了此前认为A颗粒是CVA6主要感染形式的观点，证实成熟病毒颗粒才是主要的感染性颗粒。研究首次揭示了CVA6采用双受体入侵机制：HSPG介导初始附着，KRM1触发脱壳。这一机制与EV-A71的入侵策略相似，均为HSPG介导附着，不同脱壳受体（SCARB2 for EV-A71，KRM1 for CVA6）触发后续步骤。

研究开发的两种中和抗体1F4和3H7靶向病毒衣壳三重对称轴附近的新抗原表位，该表位包含VP1 C末端、VP2 BC环和HI环、VP3 AB环和BI环。值得注意的是，该区域与EV-D68的抗原位点III相对应，表明在肠道病毒中可能存在保守的抗原表位。这两种抗体通过空间阻碍KRM1受体结合，主要作用于病毒附着后阶段，这一作用机制与KRM1的脱壳功能相一致。

尽管1F4和3H7对CVA6表现高度特异性，但对其他KRM1利用性肠道病毒无交叉中和活性，这源于其靶向的表位残基在CVA6中独特而不保守。这种高特异性虽限制了其作为广谱疗法的潜力，却使其成为CVA6特异性诊断和致病机制研究的精准工具。

该研究不仅深化了对CVA6感染机制的理解，也为抗CVA6疫苗和药物的开发提供了重要理论基础和实践指导。确定的双受体入侵机制和新型中和表位，为多靶点干预策略的设计提供了新思路。开发的高效中和抗体展现出良好的临床应用前景，有望为CVA6相关HFMD的防治提供新的解决方案。