白豆杉基因组解析紫杉烷生物合成的起源与进化之谜

《Nature Communications》：Analysis genome of Pseudotaxus chienii reveals insights into the origin and evolution of taxane biosynthesis

本研究针对红豆杉科植物紫杉烷（尤其是明星抗癌药物紫杉醇/Taxol）生物合成途径的起源与进化机制这一悬而未决的科学问题，通过对姐妹属白豆杉（Pseudotaxus chienii）进行染色体级别基因组解析、比较基因组学及代谢组学分析。研究发现白豆杉仅拥有不完整的紫杉烷合成途径，其合成流程在关键酶TBT（taxane 2α-O-benzoyl transferase）之前终止，导致大量积累紫杉素（taxusin）而非紫杉醇；而红豆杉属（Taxus）则因拥有功能性TBT等酶，进化出了完整的紫杉醇合成通路。该研究不仅揭示了紫杉醇生物合成在红豆杉科内的进化历程，为理解植物次生代谢途径的演化提供了重要案例，也为通过合成生物学策略优化紫杉醇生产提供了新思路。

　　

在植物王国中，红豆杉科植物因其能够产生著名的抗癌药物紫杉醇（Taxol^?）而备受关注。紫杉醇是一种复杂的二萜类化合物，对治疗卵巢癌、乳腺癌等多种癌症具有显著疗效。然而，紫杉醇在红豆杉植物中含量极低，且化学合成步骤繁琐，导致其价格昂贵，供应紧张。因此，解析紫杉醇的生物合成途径，并理解其在植物界的起源与进化，对于通过合成生物学策略提高产量具有重要意义。

有趣的是，紫杉醇的生物合成能力似乎并非红豆杉科所有成员所共有。白豆杉（Pseudotaxus chienii）作为红豆杉属（Taxus）的姐妹属，是中国特有的珍稀濒危裸子植物，两者在大约4830万年前分道扬镳。白豆杉是否也能合成紫杉醇？其紫杉烷代谢途径是完整还是残缺？回答这些问题，对于追溯紫杉醇这一重要药物分子在进化历史上的“发明”过程至关重要。然而，由于白豆杉参考基因组的缺失，这些问题长期悬而未决。

为了解决这一难题，杭州师范大学沈晨佳副教授、余陈镔副教授团队联合浙江省森林食品资源开发利用国家重点实验室等机构，在《自然-通讯》（Nature Communications）上发表了题为《白豆杉基因组分析揭示紫杉烷生物合成的起源与进化》的研究论文。该研究成功解析了染色体级别的白豆杉基因组（大小约15.6 Gb），并通过比较基因组学、代谢组学、酶功能验证等多组学技术，揭示了紫杉烷生物合成途径在红豆杉科内的进化蓝图。

研究人员综合利用了PacBio HiFi长读长测序、Hi-C染色体构象捕获技术进行基因组测序与组装，获得了高质量的染色体级别参考基因组。通过同源比对、转录本映射和从头预测相结合的策略进行基因注释。利用基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-IMS）技术可视化白豆杉茎叶中代谢物的组织特异性分布。通过比较基因组学分析基因家族进化、共线性关系及全基因组复制事件。利用系统发育分析、蛋白结构同源建模（SWISS-MODEL）研究萜类合酶（TPS）的进化与功能。通过异源表达（本氏烟叶片瞬时转化）和体外酶活测定验证关键基因（如PcTS1, T2OH, T7OH）的功能。结合非靶向代谢组学和LC-MS/MS靶向代谢物分析，比较白豆杉、云南红豆杉（T. wallichiana）和南方红豆杉（T. grandis）的代谢谱。通过RNA测序（RNA-seq）分析茉莉酸甲酯（MeJA）处理下的基因表达变化，并利用启动子顺式作用元件分析探讨其调控机制。

代谢物在白豆杉茎叶中的定位可视化

利用MALDI-IMS技术，研究人员成功绘制了白豆杉茎和叶切片中多种代谢物的空间分布图谱。分析发现，茎的内皮层、表皮、木质部和髓，以及叶的表皮、叶肉和维管束鞘等不同组织积累了特异性的活性成分。多种二萜类活性物质被检测到，例如牻牛儿基焦磷酸（geranyl-PP）和3D,7D,11D-植烷酸（phytanic acid）主要在茎表皮积累，而环氧化物、前角鲨烯焦磷酸（presqualene-PP）和紫杉碱B（taxine B）则高度富集于木质部。

基因组组装与注释

研究获得了大小为15.6 Gb的白豆杉基因组组装，其contig N50为65.6 Mb，并将99.0%的序列锚定到12条假染色体上。BUSCO评估显示基因组完整性为85.2%，LAI值高达10.1，表明组装质量达到参考基因组水平。共注释到35,404个蛋白质编码基因。

重复序列分析

白豆杉庞大的基因组主要归因于高比例的重复序列（86.12%），其中转座元件（TEs）占82.73%。长末端重复反转录转座子（LTR-RT）的爆发插入时间跨度长（约60至1000万年前），峰值出现在约2300万年前，Gypsy和Copia是主要的LTR类型。

全基因组复制（WGD）

共线性分析表明白豆杉与南方红豆杉（T. grandis）和美丽红豆杉（T. mairei）之间主要存在一对一同源基因，且白豆杉基因组内仅检测到少量共线性区块，表明白豆杉近期未发生全基因组复制事件，其基因组增大主要源于LTR-RT的持续插入。

共线性比较与基因家族进化

系统发育分析和分子定年表明白豆杉与红豆杉属约在4830万年前分化。研究发现红豆杉科共同祖先拥有190个扩张基因家族，而红豆杉谱系特有170个扩张基因家族，这可能与其多样化相关。白豆杉特有161个扩张基因家族，许多与次级代谢过程等相关。

紫杉烷生物合成途径的起源与进化

关键发现在于，白豆杉基因组虽然含有完整的MEP途径（提供前体）和大部分紫杉烷生物合成基因（如TS, T2OH, T7OH），但缺失了两个关键酶：紫杉烷2α-O-苯甲酰转移酶（TBT）和紫杉烷氧杂环丁烷形成酶（TOT1/CYP1）。这使得白豆杉的紫杉烷合成途径在产生10-去乙酰巴卡亭III（10-deacetylbaccatin III, 紫杉醇关键前体）之前被阻断。与此一致，代谢组学分析表明白豆杉中检测不到10-去乙酰巴卡亭III和紫杉醇，但大量积累一种高度乙酰化的紫杉烷——紫杉素（taxusin）。而在云南红豆杉中则能检测到10-去乙酰巴卡亭III、紫杉醇及其衍生物。研究表明，紫杉烷生物合成基因在白豆杉中成簇分布在9号和11号染色体上，与云南红豆杉10号染色体上的对应区域存在共线性，但经历了染色体重排和倒位，暗示了它们共同的起源。

白豆杉中TS基因的功能鉴定

系统发育分析显示，红豆杉科植物的紫杉二烯合成酶（TS）属于Class I型TPS，而其他裸子植物的TPS多为双功能型。研究人员成功克隆了白豆杉的PcTS1基因，并在本氏烟中异源表达，通过GC-MS分析证实其能催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）生成紫杉二烯（taxadiene），证明了PcTS1具有完整的TS功能。蛋白结构模拟显示，PcTS1的金属离子催化位点（如DDXXD/E和(N,D)DXX(S,T)XXXE motif）在红豆杉科中是保守的。

白豆杉中的CYP超家族

研究在白豆杉中鉴定到548个CYP基因，其中CYP725亚家族有62个成员，并在9号和11号染色体上发生串联扩张。RNA-seq分析发现，茉莉酸甲酯（MeJA）处理能特异性上调CYP725亚家族基因以及已鉴定的紫杉烷生物合成相关基因的表达。启动子分析揭示这些基因的启动子区富含MeJA响应的顺式作用元件（如G-box, G-box-like）。LC-MS/MS证实MeJA处理能显著提高白豆杉枝条中紫杉素的含量。共表达网络和顺式元件分析提示MYB12、bHLH18、WRKY6等转录因子可能参与调控紫杉烷生物合成。

综上所述，该研究通过解析白豆杉基因组，描绘了紫杉烷生物合成途径在红豆杉科内的进化路径：古老的白豆杉拥有一个不完整的、终止于TBT步骤的紫杉烷合成途径，导致代谢流向紫杉素积累；而在较晚进化出现的红豆杉属中，TBT等关键酶的获得使得途径得以延伸，最终“装配”出完整的紫杉醇合成生产线。该研究不仅增进了对植物重要药物分子合成途径起源的理解，也为利用合成生物学手段在微生物或植物底盘中间体（如紫杉素）的高效生产，进而通过生物催化或化学-酶法合成紫杉醇提供了新的策略和基因资源。同时，研究指出白豆杉作为紫杉素的重要天然来源，其本身也具有一定的开发和生态保护价值。