利用混合注入连续晶体学实时捕获铜胺氧化酶催化过程中的结构域运动

《Nature Communications》：Real-time capture of domain movements during copper amine oxidase catalysis by mix-and-inject serial crystallography

本研究针对酶催化过程中构象动态变化难以实时捕获的难题，研究人员利用混合注入连续晶体学技术，以细菌铜胺氧化酶微晶为模型，实时解析了其与底物2-苯乙基胺在毫秒时间尺度的催化过程。成功捕获到底物结合诱导的结构域运动及反应中间体，揭示了蛋白动态与催化机制的耦合关系，为酶动力学研究提供了新范式。

　　

酶是生物体内催化生化反应的关键蛋白质，其功能实现往往伴随着复杂的构象变化。然而，这些动态过程通常发生在毫秒甚至更短的时间尺度，使得实时观测酶催化过程中的精细结构变化成为结构生物学领域的重大挑战。传统晶体学方法需要冷冻样品，只能捕捉静态快照，而溶液中的光谱学技术又缺乏原子级分辨率。这种技术局限严重阻碍了人们对酶催化分子机制的理解。

铜胺氧化酶是一种广泛存在于原核和真核生物中的金属酶，参与微生物胺代谢和植物萌发等重要生理过程。该酶的独特之处在于其含有一种蛋白质衍生的醌辅因子——2,4,5-三羟基苯丙氨酸醌，该辅因子通过翻译后修饰生成，在氧化脱氨反应中起核心作用。铜胺氧化酶催化遵循乒乓机制，包括还原半反应和氧化半反应两个阶段。尽管通过常规晶体学和光谱学方法，科学家已经对该酶的反应机理有了相当深入的了解，但催化过程中原子尺度的实时结构变化仍然是个谜。

为了解决这一难题，由Takeshi Murakawa等领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们采用混合注入连续晶体学这一尖端技术，成功实时捕获了铜胺氧化酶在催化过程中结构域运动和反应中间体的形成过程。这项研究首次在原子分辨率水平上揭示了酶催化与蛋白质动态之间的直接关联。

研究团队主要运用了几项关键技术：混合注入连续晶体学结合X射线自由电子激光，实现了毫秒级时间分辨的结构数据采集；利用来自Arthrobacter globiformis的铜胺氧化酶微晶（尺寸约2.5×4微米）作为研究模型；在严格厌氧条件下与优选底物2-苯乙基胺进行反应；通过控制微晶悬浮液与底物溶液的混合点到XFEL照射点的距离和流速，精确控制反应时间（延迟时间Δt_m从22毫秒到1000毫秒）；使用专门的数据处理流程对衍射图像进行索引和整合，并基于单元细胞参数分布将数据分组进行结构精修。

MISC测量和数据处理

研究人员制备了尺寸均匀的AGAO微晶（约2.5×4微米），在厌氧条件下与底物2-PEA混合。通过调整混合点与照射点之间的距离和总流速，控制反应时间（Δt_m）在22-1000毫秒范围内。在数据处理过程中，发现在Δt_m=22、25和50毫秒时，晶胞参数a轴长度呈现双峰分布，表明微晶中存在两种不同a轴长度的区域。据此将数据分为长a轴和短a轴两组分别进行结构精修，成功解析了不同时间点的酶结构。

50毫秒内捕获的结构

对应于长a轴的数据显示，Δt_m=22-50毫秒的结构与反应前的初始酶结构相同，含有TPQ_ox和四个水分子。而短a轴数据则显示底物结合的结构，可归属为产物席夫碱。TPQ_psb结构的占比随Δt_m增加而升高，表明TPQ_psb作为亚稳态中间体被成功捕获。然而，预测的第一个中间体TPQ_ssb未能被捕获，可能因其形成和衰减速率的远快于底物扩散速率。

100-1000毫秒内捕获的结构

Δt_m=100-1000毫秒的所有数据均显示a轴缩短，表明微晶中所有AGAO分子均已与底物反应。这些时间点的精修结构包含TPQ_amr和TPQ_sq的平衡混合物。TPQ_amr相对于TPQ_sq的占有率随Δt_m增加而逐渐降低，同时在1000毫秒时降至0%。与此一致，稳定TPQ_sq自由基的Tyr296构象a的占有率随之增加。这表明在还原半反应的后期阶段，实时观察到了从TPQ_amr向TPQ_sq的转变。

底物扩散与结构变化

研究发现晶体中存在一个平行于b轴和c轴展开的平面状溶剂通道，底物可沿这两个方向扩散，而沿a轴方向的扩散则因通道不连续而受阻。这种各向异性的扩散特性导致底物结合过程成为早期反应的限速步骤。一个意外的发现是底物结合伴随着a轴的缩短。通过比较长、短a轴的结构，发现酶分子的D2和D3结构域发生了显著移动，D2结构域沿a轴正方向移动，D3结构域沿b轴负方向移动，这种结构域运动导致晶体a轴缩短约0.89埃，与观测值吻合。

活性位点残基的构象变化

研究还发现构成底物通道和结合口袋的几个残基发生了显著的构象变化。位于底物通道入口处的Phe105、Ala135、Pro136和Leu358等残基的主链构象发生变化，其侧链二面角也发生旋转，特别是Leu358像盖子一样关闭底物通道。值得注意的是，这些构象变化在反应发生后是单向的，在观测时间范围内没有恢复到初始状态。

本研究通过MISC技术成功揭示了AGAO还原半反应过程中的结构域运动，并实时捕获了催化中间体的时间分辨结构。研究发现底物结合导致蛋白质单向收缩，并伴有结构域运动和相关残基的构象变化。TPQ_sq在100-1000毫秒内的逐渐形成并非源于其自身慢速转变，而是受产物PAA解吸和新一轮底物2-PEA结合的扩散控制。这项研究不仅揭示了铜胺氧化酶催化过程中的动态结构基础，也展示了MISC技术在研究酶催化中蛋白质动力学方面的独特优势，为在原子水平制作酶催化的"翻书式"电影迈出了重要一步。