IL-17A通过组蛋白去甲基化酶JMJD3调控糖尿病创面角质形成细胞功能障碍的新机制

《Nature Communications》：IL-17A is increased in diabetic wounds and impairs keratinocyte function via histone demethylase JMJD3

本研究揭示了在2型糖尿病创面中，IL-17A信号通路通过上调组蛋白去甲基化酶JMJD3，进而调控角质形成细胞功能异常的分子机制。研究人员发现，糖尿病创面中IL-17A水平升高，通过TRAF6/NFκB通路激活JMJD3，去除抗迁移基因（Itga3, Timp1）和炎症基因（Ccl20, Cxcl1, Cxcl3, Cxcl5）启动子区的抑制性组蛋白标记H3K27me3，导致这些基因表达增加，从而损害角质形成细胞迁移能力并加剧炎症反应。特异性敲除角质形成细胞中的IL-17RA或JMJD3可改善糖尿病小鼠的创面愈合。该研究为糖尿病创面难愈提供了新的治疗靶点。

　　

在全球范围内，糖尿病已成为一个重大的公共卫生问题，其中糖尿病足溃疡是糖尿病最严重且治疗费用最高的并发症之一。约有25%的糖尿病患者会发展为足部溃疡，这些溃疡往往迁延不愈，极易感染，甚至导致截肢。正常的创面愈合是一个高度协调的过程，包括止血、炎症、增殖和重塑四个阶段。角质形成细胞作为皮肤中的主要上皮细胞，在增殖期（再上皮化）和重塑期发挥着关键作用，它们需要迁移至创面覆盖裸露的组织，并分泌多种细胞因子和基质金属蛋白酶（MMPs）以促进修复。然而，在糖尿病创面中，这一精密过程被破坏，表现为持续的炎症状态和角质形成细胞功能失调，但其背后的深层机制尚未完全阐明。

此前的研究表明，白细胞介素17A（IL-17A）在糖尿病患者的血清和创面组织中异常升高。IL-17A本是一种在早期创面愈合中促进炎症和清除病原体的关键细胞因子，但过量的IL-17A却会适得其反，导致炎症迁延不愈。尽管IL-17A在其他慢性炎症性皮肤病（如银屑病）中对角质形成细胞的影响已有报道，但它在糖尿病创面角质形成细胞功能障碍中的具体作用及其调控机制仍是一个未知领域。表观遗传调控，即不改变DNA序列而通过修饰染色质来调控基因表达的方式，在细胞功能调控中扮演着核心角色。组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3）通常是一种抑制基因转录的标记，而组蛋白去甲基化酶JMJD3（Jumonji domain-containing protein 3）可以特异性去除这一标记，从而激活基因表达。JMJD3在免疫细胞中的促炎作用已被认识，但在创面修复的非免疫细胞，特别是角质形成细胞中，其功能及上游调控机制尚不清晰。

为了回答这些问题，来自密歇根大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们发现，糖尿病创面中高水平的IL-17A正是通过诱导角质形成细胞中的JMJD3，进而表观遗传地调控一系列有害基因的表达，最终阻碍了创面的正常愈合。这项研究不仅揭示了糖尿病创面难愈的新机制，也指出了靶向IL-17A/JMJD3轴作为治疗策略的潜力。

研究人员综合运用了多种关键技术方法来验证其科学假设。研究涉及了人体样本分析，包括对2型糖尿病（T2D）和非糖尿病患者的创面组织进行批量RNA测序（RNA-Seq）、单细胞RNA测序（scRNA-Seq）和空间转录组测序，以在人体水平验证关键分子的表达差异。在动物模型方面，研究使用了两种经典的2型糖尿病小鼠模型：瘦素受体缺陷的db/db小鼠和高脂饮食诱导的肥胖（DIO）小鼠，并在此基础上构建了角质形成细胞特异性基因敲除小鼠（Il17ra^fl/flK14^cre+、Traf6^fl/flK14^cre+、Jmjd3^fl/flK14^cre+）。在细胞水平，研究采用了原代小鼠角质形成细胞和永生化人N/TERT角质形成细胞系，进行了划痕实验（评估细胞迁移）、染色质免疫共沉淀（ChIP，分析组蛋白修饰和转录因子结合）、RNA干扰（siRNA）和药理学抑制（使用JMJD3抑制剂GSK-J4和GSK-J1）等实验。此外，还通过蛋白质印迹（Western Blot）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术、免疫荧光染色等分子生物学技术对基因和蛋白表达进行了定量分析。

IL-17A信号通过调控迁移和炎症相关基因损害角质形成细胞介导的创面修复

为了探究IL-17A对角质形成细胞功能的直接影响，研究人员首先在体外用重组IL-17A（rIL-17A）刺激原代小鼠角质形成细胞和人N/TERT角质形成细胞，并进行划痕实验。结果显示，IL-17A刺激显著降低了两种细胞的迁移闭合速度。进一步的基因表达分析发现，IL-17A刺激后，角质形成细胞中抗迁移基因整合素α3（Itga3）和组织金属蛋白酶抑制剂1（Timp1）的表达上调，而促迁移基因成纤维细胞生长因子2（Fgf2）和基质金属蛋白酶2（Mmp2）的表达下调。同时，RNA测序分析揭示，一系列炎症趋化因子基因，包括Ccl20, Cxcl1, Cxcl3, Cxcl5，在IL-17A刺激后表达显著增加。利用角质形成细胞特异性IL-17受体A（IL-17RA）敲除小鼠（Il17ra^fl/flK14^cre+）模型，研究人员证实上述炎症基因的上调依赖于IL-17A信号通路。尽管使用中和抗体阻断这些趋化因子并未能挽救IL-17A导致的迁移缺陷，但数据表明IL-17A通过调控一组特定的基因损害了角质形成细胞的修复功能。

IL-17A信号通过TRAF6/NFκB通路上调组蛋白去甲基化酶JMJD3的表达

接下来，研究团队深入探索了IL-17A下游的表观遗传调控机制。通过表观遗传超级芯片阵列筛选，他们发现组蛋白去甲基化酶JMJD3对IL-17A的响应最为显著。qPCR和蛋白质印迹实验证实，IL-17A能在mRNA和蛋白水平显著上调角质形成细胞中JMJD3的表达。这种上调依赖于IL-17A信号，因为在Il17ra^fl/flK14^cre+小鼠来源的角质形成细胞中，IL-17A无法诱导Jmjd3的表达。已知IL-17A受体下游信号涉及衔接蛋白Act1和TRAF6，进而激活NFκB通路。研究人员利用Traf6^fl/flK14^cre+小鼠模型和NFκB抑制剂（IKK inhibitor VII）进行实验，发现无论是基因敲除TRAF6还是药理学抑制NFκB，都能阻断IL-17A诱导的Jmjd3上调。这证明IL-17A通过TRAF6/NFκB信号轴上调JMJD3的表达。

JMJD3直接调控IL-17A应答中的抗迁移和炎症基因，抑制JMJD3可改善角质形成细胞迁移

JMJD3的主要功能是催化去除组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3），从而解除基因抑制。染色质免疫共沉淀（ChIP）分析显示，在IL-17A刺激的角质形成细胞中，抗迁移基因（Itga3, Timp1）和炎症基因（Ccl20, Cxcl1, Cxcl3, Cxcl5）启动子区域的H3K27me3水平显著降低，而JMJD3在这些启动子上的富集增加，表明JMJD3直接参与了这些基因的表观遗传激活。为了验证JMJD3的功能必要性，研究人员使用了JMJD3的特异性抑制剂GSK-J4，或用siRNA敲低Jmjd3，均能有效逆转IL-17A诱导的上述基因表达上调。更重要的是，在角质形成细胞特异性Jmjd3敲除小鼠（Jmjd3^fl/flK14^cre+）模型中，IL-17A同样无法诱导这些有害基因的表达。功能上，抑制JMJD3（无论是药理学方法还是遗传学方法）都能显著改善IL-17A环境下角质形成细胞的迁移能力，且这种改善与细胞增殖无关。

人和小鼠糖尿病创面中IL-17A信号、JMJD3及下游靶基因表达增加

通过对人类糖尿病和非糖尿病创面样本的RNA测序分析，研究人员证实糖尿病创面中IL-17A信号通路相关基因表达增强。空间转录组分析进一步显示，在糖尿病创面中，产生IL-17A的细胞（包括髓系细胞、CD8⁺T细胞、中性粒细胞、NK细胞和CD4⁺T细胞）更靠近角质形成细胞。在糖尿病小鼠（DIO和db/db）的创面角质形成细胞中，JMJD3的mRNA和蛋白水平均显著高于对照组。同时，这些细胞中Itga3, Timp1等抗迁移基因和Ccl20, Cxcl1等炎症趋化因子基因的表达也相应升高。ChIP实验再次证实，在糖尿病小鼠的创面角质形成细胞中，上述基因启动子区的H3K27me3水平降低，而JMJD3的结合增加。单细胞RNA测序数据也表明，来自糖尿病患者的创面角质形成细胞高表达JMJD3及其靶基因。

破坏糖尿病创面角质形成细胞中的IL-17A/JMJD3级联反应可改善创面修复

最后，研究团队在体评估了靶向IL-17A/JMJD3轴的治疗潜力。在db/db糖尿病小鼠的创面局部注射JMJD3抑制剂GSK-J4，可以促进创面愈合。更重要的是，利用角质形成细胞特异性Il17ra敲除（DIO Il17ra^fl/flK14^cre+）或Jmjd3敲除（DIO Jmjd3^fl/flK14^cre+）的糖尿病小鼠模型，他们发现，特异性阻断角质形成细胞中的IL-17A信号或JMJD3功能，能显著加速糖尿病小鼠的创面闭合。组织学分析显示，基因敲除小鼠的创面再上皮化程度更好，胶原沉积更多。分子机制上，敲除IL-17RA或JMJD3后，创面角质形成细胞中抗迁移和炎症基因的表达显著下降。此外，创面中的免疫环境也得到改善，表现为TH17细胞和中性粒细胞的浸润减少，巨噬细胞的炎症表型减弱，而修复性肌成纤维细胞的标志物表达增加。

综上所述，本研究清晰地阐明了一条在糖尿病创面愈合中起关键作用的信号轴：高水平的IL-17A通过角质形成细胞表面的IL-17RA，激活下游的TRAF6/NFκB通路，进而上调组蛋白去甲基化酶JMJD3的表达。JMJD3通过去除抗迁移基因和炎症基因启动子区的抑制性组蛋白标记H3K27me3，从而“打开”这些基因的转录，最终导致角质形成细胞迁移能力受损和创面炎症反应过度，阻碍创面愈合。这项研究的重大意义在于，它不仅首次揭示了IL-17A在糖尿病创面角质形成细胞中的表观遗传调控新机制，还将JMJD3确定为糖尿病创面难愈的一个新的关键致病因子和治疗靶点。研究结果表明，细胞类型特异性地靶向角质形成细胞中的JMJD3或其上游通路，而非全身性抑制IL-17A，可能成为一种更有前景的策略，旨在恢复糖尿病创面的正常修复进程，同时避免对机体正常免疫功能造成广泛干扰。这为开发针对糖尿病慢性创面的精准表观遗传疗法提供了坚实的理论依据和实验支持。