霍乱弧菌DbfQ蛋白通过调控DbfRS双组分系统介导细菌生理适应性及生物膜生命周期

《Nature Communications》：A small periplasmic protein governs broad physiological adaptations in Vibrio cholerae via regulation of the DbfRS two-component system

本研究揭示了霍乱弧菌中一个由小周质蛋白DbfQ调控的双组分系统DbfRS，该通路通过感知外膜完整性变化，调控细菌生物膜形成与分散的平衡。研究发现DbfQ直接结合组氨酸激酶DbfS，促使其发挥磷酸酶活性，从而抑制应答调节子DbfR的磷酸化，促进生物膜分散。当外膜受损时，DbfR被磷酸化，激活包括生物膜基质基因在内的广泛转录重编程，但该状态在感染模型中表现出显著的适应性代价。该研究不仅阐明了DbfQRS通路在细菌环境适应中的核心作用，也为其作为抗感染治疗靶点提供了理论依据。

　　

在微生物的生存竞赛中，细菌进化出了精密的“雷达”系统——双组分系统（Two-component systems, TCSs），用以感知环境变化并迅速做出反应。对于霍乱弧菌（Vibrio cholerae）这类病原体而言，其在水生环境和人类宿主间的成功定植，很大程度上依赖于生物膜（biofilm）生命周期的精准调控。生物膜是细菌为抵御外界压力而构建的“堡垒”，但长期固守堡垒会消耗大量资源并限制扩散。因此，细菌必须掌握何时“筑城”（形成生物膜）以及何时“弃城”（生物膜分散）的智慧。

此前，科学家们发现了一个名为DbfRS的双组分系统，它像一位指挥官，通过控制应答调节子DbfR的磷酸化状态来决定霍乱弧菌的命运：DbfR被磷酸化时，细菌倾向于形成生物膜；反之，则启动生物膜分散。然而，这个指挥系统的“眼睛”和“耳朵”——即它如何感知环境信号，以及其调控网络的全貌——一直是个未解之谜。

为了揭开DbfRS系统的神秘面纱，来自卡内基梅隆大学等机构的研究团队在《自然·通讯》（Nature Communications）上发表了他们的最新研究成果。他们发现，在dbfRS基因座的上游，隐藏着一个编码小周质蛋白的基因dbfQ。这个不起眼的“小个子”蛋白，竟然是调控整个DbfRS信号通路活性的关键开关。DbfQ通过直接结合组氨酸激酶DbfS，促使其发挥磷酸酶活性，从而抑制DbfR的磷酸化，推动生物膜分散。当细菌外膜受到损伤时，DbfR被磷酸化，引发广泛的转录重编程，使细菌进入一种代谢减缓、生物膜增强的“应激状态”。有趣的是，这种“应激状态”虽然增强了细菌的防御能力，却以牺牲生长和定植能力为代价，这为开发新型抗感染策略提供了独特的思路。

关键技术方法

本研究综合运用了多种分子生物学、生物化学和遗传学技术。研究人员通过基因敲除、点突变和回补实验，在遗传学层面验证了DbfQ的功能及其与DbfRS通路的上下游关系。利用Phos-tag凝胶电泳和荧光素酶报告基因系统，精确监测了DbfR的磷酸化状态和通路活性。通过AlphaFold3结构预测、蛋白质下拉实验和微量热泳动（MST）技术，证实了DbfQ与DbfS感知域之间的直接、高亲和力相互作用。采用转座子插入突变筛选，结合RNA测序（RNA-seq）分析，系统性地鉴定了DbfR的调控子及其下游效应分子。最后，通过体外竞争实验和乳鼠感染模型，评估了DbfQRS通路激活对细菌适应性的影响。

研究结果

1. 小蛋白DbfQ通过调控DbfRS信号级联控制生物膜生命周期

研究人员首先发现，在dbfRS操纵子上游存在一个编码小蛋白的基因dbfQ。该基因的缺失（ΔdbfQ）会导致霍乱弧菌出现与ΔdbfS突变体类似的表型：生物膜形成增强且分散缺陷。遗传学实验表明，DbfQ的功能依赖于DbfR的磷酸化，提示DbfQ通过调控DbfS的活性来影响DbfR的磷酸化状态。Phos-tag凝胶电泳分析证实，在ΔdbfQ突变体中，DbfR完全处于磷酸化状态，而ΔdbfQ ΔdbfS双突变体则恢复了ΔdbfS单突变体的表型，表明DbfQ通过调控DbfS的激酶-磷酸酶平衡来控制DbfR的磷酸化。生物信息学分析进一步揭示，DbfQRS样遗传模块在多种细菌门中广泛存在，暗示这是一种保守的调控机制。

2. DbfQ的周质分泌和定位对其调控功能至关重要

为了探究DbfQ如何调控DbfS，研究人员首先确定了DbfQ的亚细胞定位。通过荧光显微镜观察和PhoA-LacZα融合蛋白实验，他们证实DbfQ是一个周质蛋白，其N端的分泌信号肽对于其正确的周质定位不可或缺。功能实验显示，缺失分泌信号肽（dbfQ^Δsec）或阻断信号肽切割（dbfQ^A31W和dbfQ^A31Y）的突变体均无法抑制DbfR的磷酸化，导致通路过度激活。这些结果表明，DbfQ必须被正确分泌并定位于周质空间，才能发挥其对DbfS的调控作用。

3. DbfQ直接与DbfS的感知域相互作用

AlphaFold3结构预测模型显示，DbfQ与DbfS的感知域之间存在高亲和力相互作用界面，并预测了关键的静电相互作用对（DbfQ^R84-DbfS^D62和DbfQ^K102-DbfS^E69）。研究人员通过定点突变破坏了这些相互作用，发现无论是DbfQ还是DbfS的突变体，都表现出DbfR磷酸化水平升高和通路活性增强，证明了这些相互作用在功能上的重要性。体外实验进一步证实了DbfQ与DbfS感知域的直接结合：在蛋白质下拉实验中，无标签的DbfQ能够与带有His标签的DbfS感知域共洗脱；微量热泳动（MST）分析则精确测定了两者之间的解离常数（K_d）为30 nM，并揭示了1:1的结合化学计量比。

4. DbfQRS活性对外膜完整性变化敏感

为了寻找调控DbfQRS通路的信号，研究人员进行了转座子插入突变筛选，意外发现脂多糖（LPS）生物合成基因的突变是导致通路过度激活的最主要因素。构建wavA基因（LPS核心多糖生物合成关键基因）敲除株，证实了LPS缺陷确实能显著激活DbfR的磷酸化。此外，使用亚致死浓度的膜靶向抗生素多粘菌素B（polymyxin B）和膜破坏剂百里香酚（thymol）处理野生型菌株，也能剂量依赖性地激活DbfQRS通路。这些结果表明，DbfQRS通路能够感知外膜完整性的破坏，并将其转化为信号。

5. DbfQRS通路激活生物膜形成并下调代谢过程

为了全面解析DbfR磷酸化后的生理效应，研究人员对ΔdbfS突变体进行了转录组测序（RNA-seq）分析。结果显示，DbfR磷酸化引发了广泛的转录重编程，共有540个基因的表达发生显著变化。KEGG通路富集分析表明，磷酸化的DbfR一方面上调了生物膜基质基因（vps）和肽聚糖生物合成基因的表达，另一方面则显著下调了中心代谢途径（如TCA循环和氧化磷酸化）、氨基酸代谢以及鞭毛组装相关基因的表达。软琼脂运动性实验和单细胞成像也证实，ΔdbfS和ΔdbfQ突变体的运动能力显著下降。这些结果共同描绘了一幅图景：DbfR磷酸化驱动细菌进入一种代谢减缓、运动性降低但生物膜形成增强的“固着”状态。

6. DbfR磷酸化通过上调c-di-GMP水平驱动生物膜形成

转录组数据显示，DbfR磷酸化导致多种c-di-GMP代谢酶的表达发生改变。利用c-di-GMP荧光报告系统，研究人员证实ΔdbfS突变体中的c-di-GMP水平比野生型高出约40%。为了找出介导这一效应的关键酶，他们设计了一个基于ΔdbfS突变体粗糙菌落形态的抑制子筛选。筛选结果将目光锁定在一个名为CdgL（vc_2285）的二鸟苷酸环化酶（diguanylate cyclase）上，该酶在ΔdbfS突变体中的表达上调最为显著。功能验证实验表明，在ΔdbfS背景中敲除cdgL，可以显著降低c-di-GMP水平，并几乎完全逆转其高生物膜表型。这些结果证明，CdgL是连接DbfR磷酸化与c-di-GMP水平升高、进而驱动生物膜形成的关键下游效应分子。

7. 组成型DbfR磷酸化导致霍乱弧菌适应性代价

最后，研究人员通过体外和体内竞争实验评估了DbfQRS通路激活对细菌适应性的影响。结果显示，在LB培养基和乳鼠感染模型中，ΔdbfS和ΔdbfQ突变体（DbfR磷酸化水平高）均被野生型菌株显著淘汰，竞争指数（CI）降低了10倍以上。有趣的是，即使通过敲除cdgL解除了生物膜调控，ΔdbfS ΔcdgL双突变体仍然表现出显著的适应性劣势。这表明，DbfR磷酸化所引发的广泛转录重编程（尤其是代谢过程的下调）是导致细菌适应性代价的主要原因，而非单纯的生物膜形成。

结论与讨论

本研究系统性地阐明了霍乱弧菌中一个由小周质蛋白DbfQ调控的双组分系统DbfRS的工作机制。DbfQ通过直接结合DbfS的感知域，促使其发挥磷酸酶活性，从而维持DbfR的低磷酸化状态，确保生物膜的正常分散。当细菌外膜受到损伤时，这一平衡被打破，DbfR被磷酸化，进而通过上调CdgL的表达，提高细胞内第二信使c-di-GMP的水平，最终驱动细菌进入一种代谢减缓、运动性降低但生物膜形成增强的“应激状态”。

这项研究的意义在于，它揭示了一种全新的细菌信号转导调控模式：一个小的周质蛋白可以直接作为组氨酸激酶的调节因子，精细调控其激酶与磷酸酶活性的平衡。DbfQRS通路作为一个“总开关”，能够整合外膜完整性信号，并协调生物膜形成、代谢和运动性等多个生理过程的全局性重编程。尽管这种“应激状态”有助于细菌在恶劣环境中生存，但它也带来了显著的生长和定植代价。这一“适应性代价”的发现，为开发新型抗感染策略提供了独特的视角：通过设计小分子药物来模拟外膜损伤信号，人为地“锁死”DbfQRS通路于激活状态，从而削弱病原菌的毒力，为对抗霍乱等细菌感染性疾病开辟了新的治疗途径。