实用新方法dDRTC：高效测定共价片段和先导化合物修饰速率的突破

《Nature Communications》：A practical method for determining the rate of covalent modification of fragments and leads

本研究针对现有测定共价修饰剂最严谨效价指标kinact/KI的方法存在资源密集、数据解析复杂的问题，开发了对角线剂量-反应时间过程（dDRTC）这一基于质谱的高效方法。该方法通过对KRASG12C和两个E3连接酶复合物的12个共价修饰剂验证，实现在三个数量级内准确测定kinact/KI值，通量提升8倍且数据分析简化，为共价药物早期发现提供了实用工具。

　　

随着索托拉西布（sotorasib）等共价药物在临床取得成功，共价机制在理性药物设计中的价值被重新审视。然而，共价药物开发面临一个关键挑战：如何快速准确地评估化合物的共价修饰效率。目前最严谨的效价指标——二级速率常数k_inact/K_I（共价修饰效率常数）的测定需要复杂的剂量-反应时间过程（DRTC）实验，这种方法不仅消耗大量蛋白质资源和仪器时间，数据分析也相当繁琐，难以在每周需要评估数十个化合物的先导化合物优化（SAR）研究中常规使用。

为了突破这一瓶颈，Frontier Medicines的研究团队在《Nature Communications》上报道了一种创新解决方案——对角线剂量-反应时间过程（dDRTC）方法。该方法巧妙地从传统的二维剂量-时间矩阵中选取对角线样本点，将样本量从n×n减少到n个，相当于常规IC₅₀实验的规模，却能够提供覆盖广泛剂量-时间空间的丰富信息。

研究团队首先从理论推导入手，建立了OC₅₀（产生50%占有率所需的剂量和时间乘积的倒数）与k_inact/K_I之间的数学关系：k_inact/K_I= ln2·OC₅₀。这一简洁的关系使得研究人员只需通过标准的四参数逻辑回归拟合对角线数据点，即可直接估算k_inact/K_I值，无需复杂的全局拟合软件。

关键技术方法包括：利用快速进样质谱系统（RapidFire-MS）实现高通量完整蛋白质分析；设计系统化的剂量-时间方案覆盖不同效力范围的化合物；通过动力学模拟软件（KinTek Global Kinetic Explorer）评估方法的适用边界；应用最大熵反卷积算法精确鉴定蛋白质-化合物加合物。

dDRTC与金标准方法的验证比较

研究团队以细胞活性化合物ARS-853为模型，分别采用dDRTC和传统全DRTC方法测定其对KRAS^G12C的修饰效率。dDRTC方法得到的k_inact/K_I值为215.0±7.1 M^-1s^-1，与文献报道值250±20 M^-1s^-1偏差在20%以内，而全DRTC方法的结果为274.2±0.8 M^-1s^-1，两者均与文献值高度一致。

多种共价修饰剂的广泛验证

为了进一步验证dDRTC的普适性，研究人员测试了12个共价修饰剂，包括4个KRAS^G12C抑制剂和7个针对两个E3连接酶复合物（SKP1-FBXW7和SOCS2-EloB-EloC）的化合物，效力范围覆盖1到2000 M^-1s^-1。线性回归分析显示，dDRTC与全DRTC方法之间存在近乎1:1的显著相关性（y=0.8141x，R²=0.9817），中位百分比差异仅为19%，证明dDRTC能够在大幅减少资源消耗的同时准确反映k_inact/K_I值。

动力学模拟界定方法适用边界

通过大量动力学模拟，研究团队发现dDRTC方法特别适用于可逆亲和力较低（K_I≥ 50μM）的共价修饰剂，这与早期共价先导化合物的典型动力学特征相符。例如索托拉西布的K_I> 50μM，正好处于dDRTC的最佳适用范围内。当K_I优化至低于50μM时，dDRTC与真实值的偏差会增大，特别是在低k_inact/K_I区域。

该研究的创新性在于将复杂的二维动力学实验简化为高效的单线实验，使k_inact/K_I测定变得适合常规SAR研究。与需要功能性探针的生化分析法、资源密集的全DRTC或需要蛋白质标记的表面等离子共振（SPR）相比，dDRTC具有无需探针、无需标记、通量高、数据分析简单等优势。

dDRTC方法的建立为共价药物发现提供了强有力的工具，使研究团队能够在项目更早期、更频繁地获取k_inact/K_I值，加速共价片段和先导化合物的优化进程。特别是对于缺乏已知配体或功能性检测方法的新靶点，如研究中涉及的两个E3连接酶复合物，dDRTC展现出了独特价值。该方法目前已在该研究团队内部常规使用，有望推动整个领域的共价药物发现研究向更高效、更精准的方向发展。