单细胞空间转录组整合分析揭示人颈动脉粥样硬化斑块的形态异质性

《Nature Communications》：Single cell spatial transcriptomics integration deciphers the morphological heterogeneity of atherosclerotic carotid arteries

为解决动脉粥样硬化斑块异质性及易损机制不清的问题，研究人员开展了人颈动脉斑块多组学整合研究。该研究结合Bulk RNA-Seq、scRNA-Seq和Xenium空间转录组学，揭示了斑块内细胞亚型的空间分布规律，并发现HMOX1+巨噬细胞向TREM2hi表型的局部转分化是斑块进展的关键过程，为理解斑块易损性提供了新的分子机制。

　　

动脉粥样硬化是导致心肌梗死和脑卒中等心脑血管事件的主要原因，严重威胁人类健康。动脉粥样硬化斑块是血管壁内形成的复杂结构，由脂质、纤维组织、免疫细胞和坏死核心等组成。随着斑块的进展，其形态和成分会发生剧烈变化，最终可能导致斑块破裂，引发急性血栓形成。尽管我们对动脉粥样硬化的认识不断深入，但斑块内部的细胞异质性、不同细胞亚型之间的相互作用以及驱动斑块从稳定向不稳定转变的关键分子机制，仍然是领域内亟待解决的核心问题。传统的组织学分析难以揭示细胞水平的分子变化，而单细胞测序技术虽然能提供高分辨率的细胞图谱，却丢失了细胞在组织中的空间位置信息，无法回答“谁在哪里”这一关键问题。因此，整合多种组学技术，在保留空间信息的前提下深入解析斑块的分子微结构，对于理解斑块进展和易损性至关重要。

为了回答上述问题，研究人员在《Nature Communications》上发表了一项研究，他们整合了Bulk RNA-Seq、单细胞RNA测序（scRNA-Seq）和单细胞空间转录组学（Xenium平台）三种技术，对接受颈动脉内膜剥脱术（CEA）的患者来源的斑块组织进行了系统分析。该研究不仅揭示了斑块内细胞亚型的精细空间分布，还发现了一种从HMOX1+巨噬细胞向TREM2hi表型逐步转分化的细胞轨迹，为理解斑块进展提供了新的分子机制。

关键实验方法

本研究采用多组学整合策略，主要技术方法包括：1. 样本队列：收集接受颈动脉内膜剥脱术（CEA）患者的手术标本，包括晚期斑块和配对的早期病变对照组织。2. 转录组测序：对样本进行Bulk RNA-Seq和单细胞RNA测序（scRNA-Seq），以获取全面的基因表达谱和细胞类型鉴定。3. 空间转录组学：利用Xenium平台对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片进行单细胞空间转录组分析，并采用Baysor算法进行细胞分割，以精确定位细胞在组织中的空间位置。4. 生物信息学分析：通过细胞去卷积算法校正细胞比例，利用RNA速率分析（TFvelo）推断细胞分化轨迹，并通过细胞邻域聚类分析揭示局部细胞间的相互作用。

研究结果

人颈动脉粥样硬化斑块的转录组学图谱

研究人员首先通过Bulk RNA-Seq比较了晚期斑块与早期对照组织的基因表达差异，发现晚期斑块中免疫调节因子、B细胞标志物、线粒体应激标志物以及细胞外基质降解酶等基因显著上调。然而，仅通过Bulk RNA-Seq难以区分稳定与不稳定斑块之间的差异。随后，他们利用scRNA-Seq技术，成功鉴定了内皮细胞（ECs）、血管平滑肌细胞（VSMCs）、成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞等多种细胞类型，揭示了颈动脉疾病的复杂免疫和基质景观。为了校正scRNA-Seq中免疫细胞过度富集的偏差，研究人员应用去卷积算法对Bulk RNA-Seq数据进行分析，结果显示VSMCs是斑块中最丰富的细胞类型，而巨噬细胞在斑块中显著富集。

空间组分补充转录组学图谱

为了将单细胞表达特征定位到斑块内部，研究人员利用Xenium平台进行了单细胞空间转录组学分析。通过优化细胞分割算法，他们成功识别了高水平和低水平细胞类型，以及捕获更精细转录差异的低水平亚状态。空间转录组学数据揭示了斑块内细胞类型的空间分布模式，例如VSMCs主要定位于中膜和纤维帽，而巨噬细胞则聚集在坏死核心周围和纤维帽内。

亚区域斑块分析揭示空间组织和细胞组成

通过对组织切片进行苏木精-伊红（HE）染色，研究人员确定了斑块的亚区域，包括中膜、内膜、坏死核心（NC）和纤维帽（FC）。分析发现，斑块与对照组织在亚区域面积和细胞分布上存在显著差异。斑块根据其形态和细胞组成被聚类为四个不同的形态学簇，其中“结构化”斑块（簇1和2）具有丰富的VSMCs和巨大的无细胞坏死核心，而“混乱”斑块（簇3和4）则表现出更复杂的细胞组成和空间结构。

吸烟状态影响颈动脉斑块进展

研究发现，吸烟状态与斑块的形态学聚类模式密切相关。当前或既往吸烟者的斑块倾向于聚集在形态学簇1和2，而非吸烟者的斑块则聚集在簇3和4。这种差异主要由吸烟者斑块中收缩型VSMCs细胞比例较高所驱动。Bulk RNA-Seq分析进一步证实，吸烟状态与ATM、BMPR2和TGFBRI等基因的上调相关，这些基因在吸烟相关的斑块改变中可能发挥驱动作用。

细胞邻域决定最显著的斑块特征

为了揭示局部细胞间的相互作用，研究人员对细胞的局部邻域进行了聚类分析。他们识别出了几种关键的细胞邻域类型，包括“巨噬细胞邻域”、“EC新生血管邻域”和“VSMC邻域”。在“巨噬细胞邻域”中，研究人员观察到了一个有趣的空间模式：C1Q+和HMOX1+巨噬细胞定位于管腔下，而TREM2hi巨噬细胞则位于更深的纤维帽肩部区域。这种有序的空间分层模式提示了巨噬细胞亚型在斑块内的功能分工和潜在的转分化过程。

研究结论与讨论

本研究通过整合Bulk RNA-Seq、scRNA-Seq和空间转录组学技术，深入解析了人颈动脉粥样硬化斑块的分子微结构。研究的主要结论和意义如下：

1. 1.
   揭示了斑块的形态异质性：研究将斑块分为四个不同的形态学簇，揭示了斑块在细胞组成和空间结构上的巨大异质性。这种分类方法超越了传统的稳定/不稳定二分法，为理解斑块进展的多样性提供了新的视角。
2. 2.
   阐明了巨噬细胞亚型的空间分布和转分化轨迹：研究最重要的发现之一是揭示了巨噬细胞亚型在斑块内的有序空间分布。C1Q+和HMOX1+巨噬细胞定位于管腔下，而TREM2hi巨噬细胞则位于坏死核心边缘。通过RNA速率分析（TFvelo），研究支持了HMOX1+巨噬细胞通过一个中间状态（Mac_TREM2hi_CCL18hi）逐步转分化为TREM2hi巨噬细胞的假说。这一发现揭示了巨噬细胞在斑块进展中的动态变化过程，为理解斑块炎症和脂质代谢的调控提供了新的机制。
3. 3.
   识别了关键的细胞邻域：通过细胞邻域聚类分析，研究识别了“巨噬细胞邻域”、“EC新生血管邻域”和“VSMC邻域”等关键功能区域。这些邻域反映了斑块内局部细胞间的相互作用，例如新生血管区域是免疫细胞进入斑块核心的潜在入口点，而VSMC邻域则揭示了中膜内细胞表型从收缩型向调节型转变的梯度。
4. 4.
   证实了吸烟对斑块的影响：研究发现吸烟状态与斑块的形态学特征和基因表达谱密切相关，提示吸烟是影响斑块进展和组成的重要环境因素。

综上所述，本研究通过多组学整合策略，构建了人颈动脉粥样硬化斑块的高分辨率分子图谱，揭示了细胞亚型的空间分布规律和潜在的转分化轨迹。这些发现不仅深化了我们对斑块异质性和易损性的理解，也为开发针对特定细胞亚型或细胞间相互作用的精准治疗策略提供了重要的理论基础。