构象景观的适应性变化使得Src家族激酶能够进行连续的磷酸化反应

《SCIENCE》：Conformational landscape adaptations enable processive phosphorylation by Src family kinases

本研究通过核磁共振技术解析了人类Src激酶的三种构象状态（主动、中间、不活跃），发现中间态通过动态重组关键结构元件促进ADP释放，维持高催化周转率。突变导致中间态缺失则显著降低催化效率，影响细胞迁移和T细胞激活功能。该成果揭示了构象中间态对激酶过程性磷酸化的关键作用，为靶向治疗提供新思路。

　　

编辑总结

蛋白激酶是一类受到严格调控的信号蛋白，它们利用ATP将磷酸基团添加到目标蛋白上。ADP的释放通常决定了整个反应的速率：如果ADP的释放速度比其与目标蛋白的解离速度快，那么就可以发生连续性磷酸化。Cui等人使用核磁共振光谱技术研究了人类Src激酶（一种对细胞生长至关重要的信号蛋白）中的产物释放过程。在这种条件下，激酶会呈现出三种主要的构象：活性构象、中间构象和非活性构象。中间构象虽然短暂存在，但它有助于ADP的释放；而破坏这种构象的突变会显著降低酶的催化速率，从而影响连续性磷酸化过程。——Michael A. Funk

结构摘要

引言

蛋白激酶对信号转导中心的连续性磷酸化是一种整合调节时间敏感的细胞过程信号的机制。在Src家族激酶（SFKs）中，这种能力对于细胞迁移和T细胞激活等功能至关重要。连续性磷酸化不仅要求底物具有多个磷酸化位点，还要求激酶通过连续的催化循环保持与底物的结合。腺苷二磷酸（ADP）的释放被认为是激酶催化过程中的限速步骤，因此快速释放ADP对于通过重置活性位点来促进后续磷酸化事件至关重要。深入了解这一过程中发生的构象变化对于理解催化速率以及激酶的活性和功能调控机制至关重要。

研究背景

我们利用核磁共振（NMR）技术确定了Src激酶的构象特征，并阐明了各个构象状态对催化活性的影响。其中一个主要目标是了解磷酸转移后ADP的释放机制——这一步骤常常限制着蛋白激酶的催化循环。我们通过生化和细胞实验评估了不同构象状态的功能作用，以及这些构象变化在Src家族激酶功能中的保守性。

结果

我们识别出了Src激酶的三种不同构象状态：主要构象为活性构象，另一种次要构象为Src/CDK非活性构象，还有一种新的次要构象此前未被观察到。通过对多种Src激酶变体的研究，我们发现这种新构象位于活性构象和非活性构象之间的线性过渡状态。通过NMR技术解析了这种新构象的结构，发现其具有介于活性构象和Src/CDK非活性构象之间的特征。中间构象的A环部分折叠，P环向催化位点内侧弯曲，αC螺旋向上位移。这些构象差异表明，中间构象是一种过渡状态，它通过促进关键结构元素的动态重组来连接活性构象和非活性构象。这种中间构象的一个显著特征是它具有一个过小的核苷酸结合口袋，无法容纳ADP；因此我们发现中间构象对ADP的结合能力较弱，而活性构象和非活性构象则能高效结合ADP。

我们设计了一种Src激酶变体，通过单个氨基酸替换减少了中间构象的比例，同时增加了活性构象的比例。尽管这种变体仍然呈现活性构象，但其ADP释放动力学较慢，催化周转率也低于野生型Src。其催化周转率接近Src与p130Cas解离的速率，导致体外部分磷酸化的p130Cas积累——这是分布性磷酸化机制的典型特征。值得注意的是，中间构象对于Src、Hck和Lck的连续性磷酸化过程是必需的。而那些以牺牲中间构象为代价稳定活性构象的变体会影响Src驱动的细胞迁移和Lck介导的T细胞激活。

结论

我们的研究结果表明，一种低丰度的中间构象对于Src家族激酶的连续性磷酸化功能至关重要。此外，我们还阐明了ADP释放的结构基础。其他从活性构象转变为类似非活性构象并表现出连续性磷酸化的激酶（如周期蛋白依赖性激酶）也可能使用类似的中间构象。这种结构中间体在调控催化周转速率方面起着关键作用，为开发用于治疗应用的调控方法提供了基础。

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Src激酶催化循环中的中间构象。

Src激酶通过一个促进ADP释放的中间构象在活性构象和非活性构象之间转换。这一中间构象对于Src及其他Src家族成员的连续性磷酸化过程至关重要。ATP（三磷酸腺苷）。

摘要

激酶的连续性磷酸化能够快速对信号转导中心进行多点修饰，从而在时间敏感的细胞事件中整合信号。为了实现连续性磷酸化，必须在底物解离之前完成多个催化循环，因此快速的催化周转率至关重要。Src家族激酶能够对多位点底物进行连续性磷酸化。通过核磁共振光谱技术，我们发现了Src激酶构象集合中的一个短暂中间构象，该构象位于其活性构象和非活性构象之间。这一中间构象有助于腺苷三磷酸水解后ADP的快速释放，从而确保高效的催化周转。去除中间构象会破坏Src、Lck和Hck的连续性磷酸化功能。这些发现表明，Src家族激酶的构象集合已经进化出了一种短暂构象，这种构象是其实现连续性底物磷酸化能力的基础。