从腿部溃疡中分离出的一种溃疡棒状杆菌（Corynebacterium ulcerans）临床分离株的完整基因组，其中包含两个新的毒素基因等位基因

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome of a Corynebacterium ulcerans clinical isolate with two novel toxin gene alleles isolated from a leg ulcer

该研究完成了一株携带两种新型白喉毒素基因的临床分离株Corynebacterium ulcerans的全基因组测序。通过Illumina和MinION测序技术，结合混合组装方法，确认该菌株存在两个独立且不同的白喉毒素基因（ alleles 41和42），基因间具有99.1%的序列相似性，并通过PHASTEST分析发现与假尿嘧啶tRNA的关联性。首次报道了Corynebacterium ulcerans菌株同时携带两种不同白喉毒素基因的案例。

　　

摘要

我们报告了一种临床分离的Corynebacterium ulcerans的完整基因组序列，该菌株携带两种不同且新的毒素基因等位基因。

公告

目前仅有两份关于携带两种白喉毒素基因(1, 2)的Corynebacterium ulcerans菌株的报道。加拿大国家微生物实验室的特种细菌学部门收到了一株来自安大略省一名患者腿部溃疡的C. ulcerans纯培养物(NML 200269)，用于检测白喉毒素。通过DNA导向的RNA聚合酶β亚基(rpoB)基因测序确认了该菌种。该分离株经qPCR(3)和改良的Elek测试(4)检测显示为毒素基因阳性。

该培养物保存在?80°C的Microbank管(Pro-Lab Diagnostic)中，并在含有5%羊血的Columbia血琼脂培养基上，在35°C和5% CO₂条件下培养24小时。除非另有说明，所有方法均使用默认参数。DNA提取使用Qiagen QIAmp DNA Mini Kit进行，Illumina配对末端(PE)文库的制备采用基于Hackflex原理的内部验证和优化的减少体积NexteraXT Library Prep Kit协议(5)。测序使用NextSeq2000仪器完成(600个循环，每次2 × 300 bp)。读段质量通过FastQC(v.0.72)进行评估(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)，并使用FastP(v.0.23.2)筛选phred质量大于或等于Q15的读段(6)(表1)。Illumina读段的组装使用Shovill(v.1.1.0)(https://bio.tools/shovill)和Spades(v.1.1.0)组装器完成(7)(表1)。将Illumina PE读段映射到毒素基因后，发现了一个由两个不同毒素基因组成的杂合SNP，这些基因无法仅使用Illumina技术单独组装(2)。

表1

表1Corynebacterium ulcerans菌株NML200269（Pasteur ID 7247）的测序数据及相关特征

MLST	ST 1096 (新等位基因leuA 125)
cgMLST ulcerans	cgST 845
总碱基对数	2,536,927
复制子数量	1
GC含量(%)	53.3
NCBI生物项目	PRJNA1255620
NCBI参考序列组装	GCF_050743115.1
NCBI基因组库访问号	NZ_CP189778.1
基因组覆盖度（混合组装）	740×
Illumina测序深度	255×
毒素基因1 (XUQ17417.1)	起始位置205098bp—新等位基因42
毒素基因2 (XUQ17424.1)	起始位置216518bp—新等位基因41
BLASTN tox 1 vs tox 2	1,669/1,683个匹配对，0个间隙：99.1%一致性
BLASTP Tox one vs Tox 2	557/560个匹配对，0个间隙：99.46%一致性
MinION读段数量	234,468
MinION碱基数量	1,357,541,522
MinION读段长度（N50)	9447
Illumina读段数量	2,182,244
Illumina碱基数量	557,526,010
MinION的SRA访问号	SRR33319770
Illumina的SRA访问号	SRR33319771
PGAP注释：
?基因数量	2,303
?具有蛋白质编码能力的CDS数量	2,238
?完整rRNA数量	12
?tRNA数量	50
?CRISPR阵列数量	2
?ncRNA数量	3
?完整噬菌体数量	一个完整噬菌体：位置171028bp-194151bp

为了解决这个问题，我们使用了Oxford Nanopore Technology(ONT)进行长读长测序。DNA提取方法如上所述，400 ng(基于Qubit荧光检测)的未剪切、未选大小的gDNA用于使用ONT Ligation Sequencing gDNA Native Barcoding Kit 24 V14(SQK-NBD114.24)制备文库。省略了FFPE DNA修复步骤，并在37°C下以350 rpm的速度进行AMPure清洗。测序使用ONT MinION Mk1C仪器和R10 FLO-MIN114流动池完成。碱基调用、接头修剪和多路复用使用Dorado(v. 7.6.7)软件的超高精度模式进行，未进行错误校正(https://github.com/nanoporetech/dorado)。读段质量使用Nanoplot(v1.28.2)进行评估(8)(表1)，并使用Nanoq(v.0.10.0)将读段长度筛选至至少1,000 bp(9)。

在Unicycler(Galaxy v. 0.4.8.0)中使用过滤后的Nanopore和Illumina PE fastq读段通过常规桥接模式进行了混合组装(10)。在Unicycler中，基因组被调整以从< />基因开始；使用pilon(v.1.20.1)进行 polished处理。组装图在Bandage(v.0.8.1)中可视化(12)，确认基因组为环状。组装质量使用Quast(v.5.0.2)进行评估(13)。该分离株被赋予新的MLST ST 1096(14)和新的cgMLST_ulcerans cgST 845(https://bigsdb.pasteur.fr/diphtheria/)，并通过MLST确认为C. ulcerans(15)。

通过PGAP注释(16)(表1)鉴定出两个毒素基因，PHASTEST(17)将每个基因映射到单个噬菌体下游的相同伪tRNA附近(图1)。这些新的毒素等位基因41和42(https://bigsdb.pasteur.fr/diphtheria/)通过BLASTN具有99.1%的序列一致性，通过BLASTP具有99.5%的蛋白质序列一致性(表1)。这是首次报道携带两种不同毒素基因等位基因的C. ulcerans菌株。

图1

图1NML200269基因组165至225 kbp区域的注释和可视化结果，使用Phastest(17)显示：噬菌体位于171028bp-194151bp位置(绿色)，两个毒素基因(黑色箭头，分别位于205098bp和216518bp)，以及它们相关的伪tRNA(紫色箭头和三角形)。桃色形状代表细菌基因；蓝色三角形代表噬菌体附着位点；紫色三角形代表tRNA。

致谢

我们感谢安大略省公共卫生部门提供这个有趣的菌株样本。感谢NML的DNA核心设施在M. Graham博士的领导下完成的Illumina测序工作。同时感谢巴斯德研究所团队对BIGSdb-Pasteur数据库的维护和管理。